解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷維素產(chǎn)生阿魏酸的研究

張 宸，嚴(yán) 勃，孟永宏，郭玉蓉，鄧 紅，魏麗娜

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷維素產(chǎn)生阿魏酸的研究

張 宸，嚴(yán) 勃，孟永宏*，郭玉蓉，鄧 紅，魏麗娜

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

對(duì)解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶水解谷維素產(chǎn)生阿魏酸的酶反應(yīng)體系進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母全脂肪酶粉（105U/mg）在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L黃膽酸鈉），100mmol/L pH6.0磷酸鈉緩沖液（含1000U脂肪酶）的體系中，水解產(chǎn)生阿魏酸的得率為2.94%。為了進(jìn)一步提高脂肪酶水解效率，對(duì)解脂耶氏酵母脂肪酶中主要組分lip2脂肪酶基因進(jìn)行了克隆，整合至畢赤酵母GS115基因組后發(fā)酵制取lip2脂肪酶粉（70.1U/mg），于上述酶解體系中進(jìn)行水解谷維素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿魏酸產(chǎn)率為2.87%。獲得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率，但是獲得了單一的脂肪酶基因，為進(jìn)一步采取分子進(jìn)化技術(shù)提高其催化能力奠定了基礎(chǔ)。

阿魏酸，脂肪酶，解脂耶氏酵母，酶解工藝

阿 魏 酸（Ferulic acid）是 植 物 界 常 見(jiàn) 的 一 種 酚酸，廣泛存在于當(dāng)歸、樟白皮等中藥材中[1]。它具有鎮(zhèn)靜、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂等獨(dú)特功能，且不會(huì)在人體內(nèi)過(guò)多累積[2-3]，因此，在食品、醫(yī)藥工業(yè)上得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)階段工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸的方法主要是利用高濃度堿水解谷維素得到阿魏酸。這種方法生產(chǎn)成本高，易造成環(huán)境污染[4]?？紤]到酶法水解反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境污染小，且隨著固定化酶等技術(shù)的出現(xiàn)，可大大降低反應(yīng)成本[5]，是未來(lái)工業(yè)化綠色制備阿魏酸的研究重點(diǎn)。

谷維素是由阿魏酸和環(huán)木菠蘿醇等植物甾醇構(gòu)成的結(jié)合酯，因此，可利用酯酶或脂肪酶水解酯鍵酶解谷維素制備阿魏酸[6-7]。國(guó)外已有采用酯酶來(lái)水解谷維素的先例[8]，也包括一些利用阿魏酸酯酶和多糖降解酶的協(xié)同作用[9]。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種能分泌 多 種 代 謝 產(chǎn) 物 的 非 常 規(guī) 酵 母[10]，它 能 利 用 甘 油 酯為誘導(dǎo)物，產(chǎn)生多種脂肪酶，具有很多優(yōu)良特性，是重要的工業(yè)用脂肪酶。解脂耶氏酵母共有8個(gè)脂肪酶基因，其中l(wèi)ip2脂肪酶更是一種性能優(yōu)良的脂肪酶，具備很高的酯化、水解和轉(zhuǎn)酯化活性，目前已被廣泛應(yīng)用到酯水解和合成，生物柴油制備等領(lǐng)域[11-12]。

本文選取解脂耶氏酵母為研究材料，發(fā)酵獲得全脂肪酶粉，對(duì)酶水解谷維素產(chǎn)生阿魏酸的酶解體系進(jìn)行初步篩選。同時(shí)采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得高效表達(dá)lip2脂肪酶的基因工程菌G115/lip2，并對(duì)lip2脂肪酶粉水解谷維素的能力進(jìn)行了研究，為酶法工業(yè)化制備阿魏酸的綠色工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

畢 赤 酵 母GS115、E.coli DH5α 菌 株 購(gòu) 于 中 國(guó)微 生 物 菌 種 保 藏 中 心 ；Y.lipolytica菌 株 、pPic9K質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)室保存；谷維素（純度99.3%） 西安海斯夫生物科技有限公司；阿魏酸標(biāo)品（純度99.9%）

Sigma公司；其他所有化學(xué)試劑 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司和Sigma上海分公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及相關(guān)試劑 購(gòu)自TaKaRa、Promega、Sigma 公 司 及 國(guó) 內(nèi) 各 生 產(chǎn) 廠 商 ；DNA膠回收試劑盒、DNA Marker 均購(gòu)自上海生工生物有限公司。

梯度PCR儀 Applied Biosystems公司；AG 22331型電穿孔儀 Eppendorf公司；LC-10AT型高效液相色譜儀 島津儀器蘇州有限公司；Z-16PK型低溫離心機(jī) Sigma公司。

1.2 引物

用于擴(kuò)增解脂耶氏酵母基因組上lip2脂肪酶基因的上下游引物分別為：P1（5’-AAGAATTCATGAA GCTTTCCACCATCCT-3’），P2（5’-TTGCGGCCGCTT ATTAAAGTAGATAGTT-3’），其中劃線部分分別為引入的EcoRⅠ與NotⅠ酶切位點(diǎn)；用于鑒定外源基因整合至畢赤酵母GS115基因組his4位點(diǎn)的上下游引物（依據(jù)巴斯德畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)）為：P3（5’-GACT GGTTCCAATTGACAAGC-3’），P4（5’-GGCAAATGG CATTCTGACATC-3’）。引物合成和DNA序列分析分別在南京金斯瑞生物有限公司和上海生工生物有限公司完成。

1.3 培養(yǎng)基

LB、YPD、BMGY、BMMY、MD、MM等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)。酶活檢測(cè)平板為含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY培養(yǎng)基平板；液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：魚(yú)蛋白胨6%，豆油4%，尿素0.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，其中尿素過(guò)濾除菌（0.22μm）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 脂肪酶粉的制備 挑取酵母菌單菌落接種于5mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)12～14h，然后以1%接種量接種至脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，220r/min發(fā)酵72h；將發(fā)酵液于3000r/min離心10min，取上清酶液并加入3%的PEG2000，電磁攪拌2h溶解，濾紙過(guò)濾后取濾紙上的固體物質(zhì)，加入3倍體積的冷酒精洗脫3次，冷丙酮洗2次，最后制得的固體自然風(fēng)干，即得到酶粉[13]。

1.4.2 酶粉酶活測(cè)定方法 脂肪酶活性測(cè)定采用堿滴定法[14]。操作步驟如下：酶活力測(cè)定以橄欖油乳化液（橄欖油∶PVA=1∶3，v/v）為底物。取37℃溫浴后的5mL橄欖 油 乳 化 液 和4mL 100mmol/L pH8.0的 PBS，加入適當(dāng)溶解稀釋的1mL脂肪酶粉，于37℃、130r/min反應(yīng)10min，加入15mL無(wú)水乙醇以終止反應(yīng)。酶催化水解產(chǎn)生的脂肪酸通過(guò)50mmol/L的NaOH滴定測(cè)定，加兩滴0.5%酚酞指示滴定終點(diǎn)。在37℃，pH8.0的條件下，脂肪酶每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1μmol/L游離脂肪酸所需的酶量定義為一個(gè)活力單位（U）。

1.4.3 阿魏酸含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法對(duì)阿 魏 酸 含 量 進(jìn)行 檢測(cè)[15]，檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 為315nm，色 譜 柱為Welch Ultimate XB-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm，Welch Materials公司），流動(dòng)相組份及配比為甲醇∶水∶冰乙酸=35∶65∶0.9，流速為1.0mL/min。

1.4.4 脂肪酶粉水解谷維素酶解體系實(shí)驗(yàn) 取20mg的谷維素樣品于500μL丙酮溶解后加入25mL具塞三角瓶中，并在不同的水解體系[8，16-17]中（水解體系見(jiàn)結(jié)果中表1）加入1000U脂肪酶粉，于37℃，140r/min反應(yīng)48h。以HPLC法測(cè)定阿魏酸含量并計(jì)算得率。

1.4.5 載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 以解脂耶氏酵母基因組DNA為模板，利用P1和P2為引物擴(kuò)增lip2基因，PCR產(chǎn)物膠回收純化并與pGEM T-easy載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α后篩選陽(yáng)性克隆子，插入的基因通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。對(duì)測(cè)序正確的克隆子過(guò)夜培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，使用EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切得到具有粘性末端的目的條帶，經(jīng)T4連接酶16℃過(guò)夜連接至用相同內(nèi)切酶雙酶切后的表達(dá)載體pPic9K中，構(gòu)建得到pPic9K/lip2重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pPic9K/lip2按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)，用his4位點(diǎn)上的SalⅠ內(nèi)切酶得到10μg線性化質(zhì)粒DNA與80μL GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，1.5kV電擊轉(zhuǎn)化后將細(xì)胞涂布到不含組氨酸MD平板上，28℃培養(yǎng)2～3d，成功轉(zhuǎn)化的his+轉(zhuǎn)化子可在無(wú)組氨酸的MD平板上生長(zhǎng)。

1.4.6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子表型鑒定、篩選及驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)化后所得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于MD和MM平板上進(jìn)行Mut+/Muts表型鑒定；并采用G418濃度梯度YPD平板篩 選 畢 赤 酵 母 多 拷 貝 轉(zhuǎn) 化 子[19]；以 篩 選 得 到 轉(zhuǎn) 化 子的基因組為模板，P3和P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證基因表達(dá)盒的正確插入；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子點(diǎn)接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，觀察其脂肪酶表達(dá)能力[18]。陽(yáng)性重組子命名為GS115/lip2。

1.4.7 lip2脂肪酶粉水解谷維素實(shí)驗(yàn) 對(duì)重組子經(jīng)發(fā)酵制取的lip2脂肪酶粉，測(cè)定其脂肪酶活性，并運(yùn)用全脂肪酶粉最優(yōu)酶解體系進(jìn)行谷維素水解實(shí)驗(yàn)，HPLC法測(cè)定阿魏酸含量，并計(jì)算阿魏酸得率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

阿魏酸得率的按照下式進(jìn)行計(jì)算：

表1 解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷維素制取阿魏酸的得率Table 1 The ferulic acid yield of oryzanol hydrolysis by Yarrowia lipolytica lipase powder

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶水解谷維素酶解體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

通過(guò)1.4.1方法制取解脂耶氏酵母全脂肪酶粉，并經(jīng)堿滴定法測(cè)得解脂耶氏酵母全脂肪酶粉酶活為105U/mg。

由表1可知，未加入解脂耶氏酵母全脂肪酶粉的體系2和體系3中，阿魏酸產(chǎn)量很少或者幾乎沒(méi)有，其中，含牛黃膽酸鈉的體系2水解效率略優(yōu)于不含牛黃膽酸鈉的體系3，說(shuō)明牛黃膽酸鈉作為乳化劑，可增大反應(yīng)液中油水兩相的接觸面積，使更多的谷維素與水相遇發(fā)生水解反應(yīng)，進(jìn)而提高了阿魏酸的得率。體系1、4、5、6中均加入了1000U的全脂肪酶粉，阿魏酸得率均有很大的提高。說(shuō)明解脂耶氏酵母脂肪酶粉對(duì)谷維素確實(shí)具有水解作用，但其阿魏酸得率不高。對(duì)比體系1與體系4可以得出，使用牛黃膽酸鈉作為乳化劑其作用效果優(yōu)于使用PVA-1750作為乳化劑；而使用50mmol/L pH7.0 Tris-HCl作為酶解反應(yīng)的緩沖液，阿 魏 酸 產(chǎn) 量 要 大 于 使 用100mmol/L pH7.0 PBS的 反應(yīng)緩沖液，其原因可能是由于Tris-HCl中的離子更能保護(hù)及穩(wěn)定脂肪酶的構(gòu)象及活力，使其在反應(yīng)體系中保持穩(wěn)定的底物轉(zhuǎn)化能力。由阿魏酸得率可知，谷維素在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L牛黃膽酸鈉），100mmol/L pH6.0磷酸鈉緩沖液（含1000U脂肪酶）的酶解體系中得率最高，產(chǎn)率可達(dá)到2.94%。

圖1 lip2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（A）及pPic9K-lip2雙酶切驗(yàn)證（B）Fig.1 PCR amplification of Y.lipolytica lip2 gene（A） and double digestion of the plasmid by EcoRⅠ and NotⅠ（B）

2.2 lip2脂 肪 酶 基 因 的 克 隆 與pPic9K-lip2表達(dá)載體的構(gòu)建

以解脂耶氏酵母DNA為模板，P1和P2作為引物擴(kuò)增得到的lip2脂肪酶基因，大小約為1005bp，見(jiàn)圖1（A）。測(cè)序結(jié)果與NCBI上lip2脂肪酶基因序列比對(duì)結(jié)果序列一致。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，lip2脂肪酶蛋白含334個(gè)氨基酸，其蛋白分子式為C1659H2549N437O488S13，相對(duì)分子質(zhì)量為36840.9，等電點(diǎn)為5.57，總原子數(shù)為5146；脂溶指數(shù)為93.38，疏水性平均值為-0.005，說(shuō)明lip2脂肪酶是一個(gè)脂溶性、疏水性蛋白。

PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆，對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆子抽提質(zhì)粒，與載體pPic9K分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切處理后T4過(guò)夜連接，構(gòu)建分泌型表達(dá)載體pPic9K-lip2（圖2）。pPic9K-lip2雙酶切電泳見(jiàn)圖1（B），測(cè)序分析結(jié)果驗(yàn)證載體構(gòu)建正確。

圖2 畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPic9K-lip2框架圖Fig.2 Schematic diagram of the Pichia recombinant expression plasmids pPic9K-lip2

2.3 畢赤酵母重組子的轉(zhuǎn)化和鑒定

經(jīng)內(nèi)切酶SalⅠ線性化后的表達(dá)載體pPic9K-lip2電轉(zhuǎn)化至P.pastoris GS115中，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)MD和MM平 板 鑒 定 為His+/Mut+ 型 。 于 高G418 濃 度（＞1.5mg/mL）的抗性平板上篩選得到畢赤酵母多拷貝轉(zhuǎn)化子，共計(jì)16株。異硫氫酸胍法快速提取畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，P3和P4為引物，PCR驗(yàn)證基因表達(dá)盒是否成功插入畢赤酵母基因組his4位點(diǎn)，結(jié)果如圖3所示。從PCR結(jié)果來(lái)看，篩選到的畢赤酵母GS115/lip2重組子都能擴(kuò)增出兩條片段，分別是AOXI基因片段（2.2kb）和約1.5kb片段（片段大小=目的基因長(zhǎng)度+492bp），表明所挑選的轉(zhuǎn)化子都是陽(yáng)性克隆，且屬于Mut+型。

圖3 畢赤酵母GS115/lip2陽(yáng)性重組子的PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR of positive recombinant

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子點(diǎn)接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，培養(yǎng)24~48h后，發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)性重組子均能產(chǎn)生水解透明圈（圖4）說(shuō)明畢赤酵母GS115/lip2重組子可以有效表達(dá)脂肪酶。

圖4 畢赤酵母GS115/lip2重組子分解三丁酸甘油脂產(chǎn)生透明圈Fig.4 Transparent circle formation of recombinant on tributyrin agar plate

2.4 lip2脂肪酶粉水解谷維素制取阿魏酸實(shí)驗(yàn)

對(duì)16株畢赤酵母GS115/lip2重組子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分別對(duì)發(fā)酵液測(cè)定其脂肪酶活力。選取催化活力最高的一株重組子重新進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)1.4.1方法制取lip2脂肪酶粉，經(jīng)堿滴定法測(cè)得lip2脂肪酶粉酶活達(dá)到了70.1U/mg。

以2.1中的最優(yōu)水解體系（體系1和體系5）按1.4.4方法進(jìn)行l(wèi)ip2脂肪酶酶粉水解谷維素制備阿魏酸實(shí)驗(yàn)，HPLC法測(cè)定阿魏酸產(chǎn)量，體系1和體系5阿魏酸得率分別為2.07%和2.87%。由結(jié)果可知，畢赤酵母GS115/lip2重組子lip2脂肪酶粉對(duì)谷維素具有一定水解作用，且阿魏酸得率略低于解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷維素的阿魏酸得率（約2.94%）。其原因可能在于：一是全脂肪酶粉中可能含有對(duì)谷維素水解效率較高的其他同工脂肪酶；二是各個(gè)脂肪酶作用于谷維素時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，提高了脂肪酶的單一作用效果。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)了解脂耶氏酵母脂肪酶對(duì)谷維素有一定的水解作用，但是阿魏酸得率較低?？赡艿脑蛴校航庵辖湍钢久腹染S素水解特異性較差，水解效率不高；酶水解反應(yīng)體系還需要繼續(xù)優(yōu)化和篩選；所制得的脂肪酶粉酶活相對(duì)較低，酶粉質(zhì)量不高，其在酶水解谷維素體系中的擴(kuò)散性不好，可能也會(huì)影響到對(duì)谷維素的水解效率。

另外，在解脂耶氏酵母基因組中有l(wèi)ip1~lip8脂肪酶同工酶基因。本文只研究了lip2脂肪酶水解谷維素制備阿魏酸的能力，其他的同工酶基因可以參照本文中的方法繼續(xù)研究，有一定的借鑒意義。

3 結(jié)論

對(duì)解脂耶氏酵母發(fā)酵所制得的全脂肪酶粉，進(jìn)行了谷維素酶水解制備阿魏酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母全脂肪酶粉對(duì)谷維素有一定的水解效率，水解反應(yīng)條件為：50mmol/L pH7.0 Tris-HCL（包含7.5mmol/L牛 黃 膽 酸 鈉），100mmol/L pH6.0 磷 酸 鈉 緩沖液（包含1000U脂肪酶粉），阿魏酸得率為2.94%。同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)手段，成功獲得了高效表達(dá)lip2脂肪酶基因的GS115/lip2基因工程菌，研究發(fā)現(xiàn)其制得的lip2脂肪酶對(duì)谷維素也具有水解作用，阿魏酸得率為2.87%。通過(guò)本研究，證明了解脂耶氏酵母lip2脂肪酶對(duì)谷維素有一定的水解效率。因此，可在本研究的基礎(chǔ)上，可利用分子進(jìn)化技術(shù)，對(duì)lip2脂肪酶基因進(jìn)行分子改造，繼續(xù)進(jìn)行高效能脂肪酶的篩選研究，以期獲得高谷維素特異性的酵母菌脂肪酶，為酶法工業(yè)化水解谷維素制備阿魏酸的綠色工藝奠定基礎(chǔ)。

[1]梁娜，孫少平，羅躍娥，等.阿魏酸的研究進(jìn)展[J].黑龍江中醫(yī)藥，2009（3）：39-40.

[2]Ou Shiyi，Kwok K C.Review Ferulic acid：pharmaceutical functions，preparation and applications in foods[J].J Sci Food Agr，2004，84（11）：1261-1269.

[3] 邵艷清，李海燕. 阿魏酸含量分析方法概述[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（4）：505-506.

[4] 趙東平，楊文鈺，陳興福. 阿魏酸的 研究進(jìn)展[J]. 時(shí) 珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（8）：1839-1841.

[5]張璟，歐仕益，張寧，等.酶解麥麩制備阿魏酸和低聚糖的研究[J]. 食品科學(xué)，2004，24（11）：63-68.

[6]Sancho A I，Bartolomé B，Gómez-Cordovés，et al.Release of ferulic acid fromcereal residues by barley enzymatic extract[J].J Cereal Sci，2001，34（2）：173-179.

[7]Kroon P A，Garcia-Conesa M T，F(xiàn)illingham I J，et al.Release of ferulic acid dchydrodimers from plant cellwalls by feruloyl esterases[J].J Sci Food Agric，1999，79：428-434.

[8]Miller A ，Majauskaite L ，Engel K H.Enzyme-catalyzed hydrolysis of γ -oryzanol[J].Eur Food Res Technol，2004，218（4）：349-354.

[9]Mathew S，Abraham T E.Studies on the production of feruloyl esterase from cereal brans and sugar cane bagasse by microbial fermentation[J].Enzyme Microb Technol，2005，36（4）：565-570.

[10]Madzak C，Gaillardin C，Beckerich J M.Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica：a review[J].J Biotechnol，2004，109（1）：63-81.

[11]Yu M，Wen S，Tan T.Enhancing production of Yarrowia lipolytica lipase lip2 in Pichia pastoris[J].Eng Life Sci，2010，10（5）：458-464.

[12]Rywińska A，Juszczyk P，Wojtatowicz M，et al.Glycerol as a promisingsubstrate forYarrowia lipolytica biotechnological applications[J].Biomass Bioenergy，2013，48：148-166.

[13]李璟，王燕，楊山虎，等.固定化微生物脂肪酶粉轉(zhuǎn)化生物柴油研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（3）：494-498.

[14] 楊華，婁永江.國(guó)產(chǎn)堿性脂肪酶的測(cè)定方法及特性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2006，6（3）：138-142.

[15]廖律，周明達(dá)，肖勁，等.米糠中阿魏酸的提取及高效液相色譜法測(cè)定[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（2）：217-219.

[16]Laura N，Robert A M，Lamp A M，et al.Enzymatic hydrolysis of steryl ferulates and steryl glycosides[J].Eur Food Res Technol，2008，227（3）：727-733.

[17]McClendon S D，Shin H D，Chen R R.Novel bacterial ferulic acid esterase from Cellvibrio japonicus and its application in ferulic acid release and xylan hydrolysis[J].Biotechnol Lett，2011，33：47-54.

[18]郭美錦，朱泰承，張明，等.重組畢赤酵母甲醇利用表型與基因拷貝數(shù)對(duì)外源基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2007，27（7）：7-11.

[19]Lanser A C，Manthey L K，Hou C T.Regioselectivity of new bacterial lipases determined by hydrolysis of triolein[J].Curr Microbiol，2002，44（5）：336-340.

Production of ferulic acid from oryzanol by Y.lipolytica lip2 enzyme-catalyzed

ZHANG Chen，YAN Bo，MENG Yong-hong*，GUO Yu-rong，DENG Hong，WEI Li-na
（Shaanxi Normal University，College of Food Engineering and Nutritional Science，Xi’an 710062，China）

An appropriate enzymatic system was preliminary explored for the Yarrowia lipolytica lipase.The study found that the optimal enzyme reaction system for the whole lipase powder was 50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（containing 7.5mmol/L ammonium taurocholate），100mmol/L pH6.0 PBS（containing 1000U lipase powder），and the ferulic acid yield was 2.94%.To further improve the efficiency of hydrolysis of lipase，lip2 lipase gene was cloned and integrated in Pichia pastoris GS115 genome，and the lip2 lipase powder was obtained by fermentation.Using the optimal enzyme reaction system to hydrolysis oryzanol，the results showed that the ferulic acid yield by lip2 lipase powder was 2.87%.This efficiency was slightly lower than the whole lipase powder hydrolysis efficiency.However，a single lipase gene was obtained，which would lay the foundation of improving the catalyze ability to hydrolysis oryzanol by molecular evolution technology.

ferulic acid；lipase；Yarrowia lipolytica；hydrolysis process

TS222.1

A

1002-0306（2014）22-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.033

2014－02－24

張宸（1988-），女，碩士研究生，主要從事食品生物工程方面的研究。

* 通訊作者：孟永宏（1975-），男，博士，副教授，主要從事食品生物工程方面的研究。

陜西省科技統(tǒng)籌（2011KTCQ02-04）；教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20130202120007）；2012年度中央高?？蒲谢緲I(yè)務(wù)費(fèi)重點(diǎn)項(xiàng)目。