茶多酚與茶皂素及其復(fù)配液的抑菌作用研究

晏秀梅，魏 靜，許靖逸，李 解，郭 襄

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625000）

茶多酚與茶皂素及其復(fù)配液的抑菌作用研究

晏秀梅，魏 靜，許靖逸*，李 解，郭 襄

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川雅安 625000）

采用牛津杯法，研究不同濃度茶皂素、茶多酚單獨(dú)使用與復(fù)配使用對(duì)食品常見(jiàn)污染菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用。結(jié)果表明，茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），呈現(xiàn)隨濃度增大其抑菌作用越強(qiáng)的趨勢(shì)；茶皂素和茶多酚復(fù)配使用時(shí)表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抑菌作用，復(fù)配液抑菌效果與濃度成正相關(guān)，特別是一定濃度的茶皂素中復(fù)配不同濃度的茶多酚對(duì)兩種菌的抑制作用明顯強(qiáng)于同濃度茶皂素的抑菌活性；同時(shí)，同濃度的茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑制作用均強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。研究顯示，茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液均具有良好的抑菌效果，抑菌作用與濃度成正相關(guān)。

茶多酚，茶皂素，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，抑菌效果

茶 葉 中 含 有 茶 多 酚（tea polyphenols，TP）、茶 皂素（tea saponin，TS）和氨基酸等多種生物活性物質(zhì)[1]，對(duì)人體具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中茶多酚是茶葉中的主要化學(xué)成分，大量研究表明，茶多酚具有較強(qiáng)的消除自由基、抗輻射、抗癌和抗衰老等作用[2]。另外，茶多酚還有抑菌作用，能防止食物腐敗變質(zhì)[3]，延長(zhǎng)食品的保鮮期，是一種安全理想的抗氧化劑和抑菌劑，在果蔬、肉制品、糕點(diǎn)等方面的防腐保鮮中得到廣泛應(yīng)用。茶皂素是茶籽中含量較高的一種化學(xué)成分，不僅具有良好的乳化、發(fā)泡及潤(rùn)滑等表面活性作用[4]，而 且 具 有 明 顯 的 抗 病 毒[5]、抗 菌 消 炎[6]、殺 蟲(chóng) 驅(qū)蟲(chóng)[7]等作用，對(duì)典型革蘭氏細(xì)菌、酵母菌也具有強(qiáng)烈抑制作用，具有食品防腐和保鮮功能[8]。國(guó)內(nèi)外研究表明，將幾種不同的天然防腐劑配合使用，可使食品殺 菌 條 件 更 趨 溫 和 ，達(dá) 到 互 補(bǔ) 或 協(xié) 同 增 效 作 用[9-10]。已有研究表明，茶多酚與一些植物提取物復(fù)配具有協(xié)同抑菌效果。但將茶葉中提取的茶多酚和茶皂素進(jìn)行混合抑菌實(shí)驗(yàn)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)以茶多酚和茶皂素為抑菌材料，通過(guò)牛津杯法[11]，觀察茶多酚和茶皂素單獨(dú)使用以及兩者按一定比例復(fù)配使用對(duì)兩種常見(jiàn)食品污染菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果，為高效、安全、經(jīng)濟(jì)的新型天然防腐劑的開(kāi)發(fā)和研制開(kāi)辟新途徑，為茶副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大 腸 桿 菌（Escherichia coli），金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus） 均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品質(zhì)量與安全研究室提供；茶多酚（純度90%）食品級(jí)，四川省克魯尼茶葉生物科技有限公司；茶皂素（純度90%） 從茶籽中提取，杭州青田中野天然植物科技有限公司。

HPG-280B型光照培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SS-325型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；牛津杯 內(nèi)徑6mm，外徑8mm，廣州北銳精密儀器有限公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，瓊脂粉2g，氯化鈉0.5g，蒸餾水100mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌平板計(jì)數(shù)及菌懸液的制備 在無(wú)菌操作臺(tái)上，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。然后從斜面瓊脂培養(yǎng)基上分別挑出受試菌株的菌落，劃線接種到適宜的平板培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，按常規(guī)平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)平板計(jì)數(shù)的結(jié)果，選取待測(cè)菌并用無(wú)菌生理鹽水稀釋到1×106CFU/mL，以備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 茶多酚、茶皂素及其復(fù)配溶液的配制 茶多酚溶液的制備：在超凈工作臺(tái)上，準(zhǔn)確稱取用紫外滅菌的茶多酚粉末0.5g，用無(wú)菌蒸餾水溶解并定容至50mL，制成10mg/mL的溶液。取已配制的10mg/mL茶多酚溶液10mL至50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，制成2.0mg/mL的溶液。再依次稀釋成1.6、1.0mg/mL的溶液，分別作為1、2、3處理組。

茶皂素溶液的制備：在超凈工作臺(tái)上，稱取用紫外滅菌的茶皂素粉末5.0g，用無(wú)菌蒸餾水溶解并定容至50mL，制成100mg/mL的茶皂素溶液。取已配制的100mg/mL的茶皂素溶液25mL于50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，制成50mg/mL的溶液。照此方法稀釋成25mg/mL的濃度，分別作4、5、6處理組。

茶多酚與茶皂素復(fù)配液的配制：將上述配制好的茶皂素和茶多酚溶液以同體積相復(fù)配，復(fù)配液濃度分別為（2.0+100.0）、（2.0+50.0）、（2.0+25.0）、（1.60+ 100.0）、（1.60+50.0）、（1.60+25.0）、（1.0+100.0）、（1.0+ 50.0）、（1.0+25.0）mg/mL（括號(hào)中，前面的數(shù)字為茶皂素濃度，后面的數(shù)字為茶多酚濃度）。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用雙層平板透明圈法，即在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入5mL高壓滅菌的瓊脂（下層），待凝固后，迅速在平板上十字形放入4只滅過(guò)菌的牛津杯。在無(wú)菌條件下加入混有受試菌的培養(yǎng)基15mL（上層按100mL培養(yǎng)基中加入濃度為1×106CFU/mL的受試菌懸液1mL）。待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，分別向每個(gè)孔中加入上述制備好的茶皂素、茶多酚及兩者復(fù)配液100μL，空白對(duì)照為相同體積的無(wú)菌蒸餾水。將平板置于37℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20h后觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑，每個(gè)抑菌圈測(cè)量3次，每個(gè)濃度做3次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性

由表1可知，茶多酚和茶皂素單獨(dú)使用時(shí)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用，并隨濃度增大抑菌作用增強(qiáng)，其中當(dāng)茶多酚溶液的濃度為2.00mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑菌圈極顯著大于濃度分別為1.6mg/mL和1.00mg/mL茶多酚溶液的抑菌圈（p＜0.01）；當(dāng)茶皂素的濃度為100.00mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈極顯著大于其他兩個(gè)低濃度的（p＜0.01）。說(shuō)明茶多酚、茶皂素對(duì)大腸桿菌的抑菌作用與其濃度有關(guān)。當(dāng)茶多酚和茶皂素按一定比例復(fù)配時(shí)，總體上隨著兩者復(fù)配液濃度比例的增大抑菌效果增強(qiáng)，抑菌效果優(yōu)于同濃度的兩者單獨(dú)使用的抑菌作用。當(dāng)茶多酚濃度為2.0mg/mL與濃度為100mg/mL茶皂素復(fù)配時(shí)，抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為18.10mm，極顯著大于其他濃度的復(fù)配液（p＜0.01）。表明茶皂素和茶多酚復(fù)配對(duì)大腸桿菌的抑菌效果強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用的抑菌效果，即適當(dāng)濃度的茶多酚和茶皂素復(fù)配具有一定的協(xié)同增效作用，其協(xié)同效應(yīng)與兩者復(fù)配的濃度成正相關(guān)。

表1 茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Table 1 The inhibition effect of tea polyphenols and tea saponin and their blends against Escherichia coli

2.2 茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

由表2可知，茶多酚和茶皂素單獨(dú)使用時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用，并隨兩者濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)。其中當(dāng)茶多酚溶液的濃度為2.00mg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈顯著大于濃度為1.60mg/mL和1.00mg/mL茶多酚（p＜0.05）。當(dāng)茶皂素的濃度為100.00mg/mL時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈極顯著大于其他兩組濃度（p＜0.01）。且當(dāng)茶多酚和茶皂素按一定比例復(fù)配后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用隨著兩者復(fù)配濃度的增大，抑菌效果越明顯，其中以濃度為2.0mg/mL茶多酚和濃度為100mg/mL茶皂素復(fù)配時(shí)，抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為13.89mm，極顯著大于其他濃度的復(fù)配液（p＜0.01）。說(shuō)明茶多酚和茶皂素聯(lián)合使用的抑菌活性高于單獨(dú)使用同濃度茶多酚的抑菌活性，兩者復(fù)配表現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用，以兩者高濃度復(fù)配效果最明顯。

表2 茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 2 The inhibition effect of tea polyphenols and tea saponin and their blends against Staphylococcus aureus

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)兩種食物病原菌都具有不同程度的抑制作用，同等濃度的茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，推測(cè)其原因可能與這兩種菌種類(lèi)、生長(zhǎng)的pH及茶多酚和茶皂素對(duì)微生物的抑菌具有選擇性等有關(guān)。另外，茶多酚和茶皂素具有協(xié)同抑菌作用，隨著兩者復(fù)配液濃度比例的增大，抑菌效果增強(qiáng)，特別是一定濃度的茶皂素中復(fù)配不同濃度的茶多酚對(duì)兩種菌的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用茶皂素的抑菌活性，茶皂素增效茶多酚的作用可能是由于茶皂素的表面活性劑性質(zhì)加大了茶多酚與細(xì)菌接觸的表面積，提高了茶多酚的有效作用濃度，或是茶皂素對(duì)細(xì)菌造成的氧化性損傷，增強(qiáng)了病原菌對(duì)茶多酚的敏感性[12-13]。

3 討論

茶多酚和茶皂素是茶葉和茶籽中的兩類(lèi)重要的功能性化合物。茶多酚通過(guò)影響細(xì)菌的培養(yǎng)液電導(dǎo)率和總糖濃度、影響細(xì)菌磷代謝、與蛋白質(zhì)和金屬離子 結(jié) 合 等 方 式 抑 制 大 部 分 腸 道 內(nèi) 有 害 菌 的 生 長(zhǎng)[14]，且具有廣譜、強(qiáng)效、低毒的抗菌活性，同時(shí)能促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，因此廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、日化、養(yǎng)殖等方面。結(jié)果表明，茶皂素和茶多酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌作用，這與文莉等的結(jié)果一致[14-15]，且茶皂素對(duì)茶多酚的抑菌作用具有很好的增效作用，這與潘任桃等的茶皂素增效4種抗菌藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[12]。由此可知，茶皂素與抗菌藥物的協(xié)同增效作用，可擴(kuò)大抗菌藥物的抗菌譜，減少用藥量，可開(kāi)發(fā)為食品防腐劑。我國(guó)是產(chǎn)茶大國(guó)，每年產(chǎn)生4.4億噸茶籽，其中絕大部分被廢棄。據(jù)研究，茶籽中含有12%~15%的茶皂素。另外，茶葉的修剪枝葉、茶末、茶葉深加工產(chǎn)生的茶渣中仍含有茶多酚、茶皂素等成分，但很少得到利用，造成了巨大的資源浪費(fèi)。因此，加強(qiáng)對(duì)茶籽及茶副產(chǎn)物資源的利用研究，從中提取茶多酚、茶皂素等天然成分應(yīng)用于食品防腐保鮮不僅原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，而且毒副作用小，對(duì)人體安全，還可實(shí)現(xiàn)企業(yè)的快速可持續(xù)發(fā)展，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為高效、安全、經(jīng)濟(jì)的新型天然防腐劑的開(kāi)發(fā)和研制開(kāi)辟新途徑，為茶副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

李 增 禮 的 研 究 表 明[16]，茶 多 酚 濃 度 在 一 定 范 圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論，而國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)明確規(guī)定茶多酚作為食品添加劑使用時(shí)要求其含量低于10.0mg/mL[14]，所以本實(shí)驗(yàn)選用的茶多酚最高濃度為2.0mg/mL。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚、茶皂素及其復(fù)配物對(duì)食品常見(jiàn)污染菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用，隨濃度增大其抑菌作用越強(qiáng)，且兩者聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同抑菌效果，與兩者濃度成正相關(guān)。其中以一定濃度的茶多酚復(fù)配茶皂素抑菌效果較好，即茶皂素對(duì)茶多酚具有增效作用。同時(shí)，相同濃度的茶多酚、茶皂素及其復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑制作用均強(qiáng)于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，但其抑菌機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Study on antibacterial activities of tea polyphenols and tea saponin and their blends

YAN Xiu-mei，WEI Jing，XU Jing-yi*，LI Jie，GUO Xiang
（College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625000，China）

To evaluate the antibacterial activities of tea saponin and tea polyphenols and their blends on Escherichia coli and Staphylococcus aureus of common pollutant and pathogenic bacteria in foods，the Oxford Cup method were used to study their antibacterial activities.The results showed that tea polyphenols and tea saponin and their blends could significantly inhibit Staphylococcus aureus and Escherichia coli（p＜0.05 ） ，the antibacterial effect gradually increased along with the increasing concentration of tea saponin and tea polyphenols，and the inhibition was enhanced with their increasing concentration.Tea saponin and tea polyphenols demonstrated a synergistic inhibitory effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus and synergistic inhibitory effect was enhanced with their increasing concentration.Tea saponin mixed with different concentration of tea polyphenols had better antibacterial effect than the same concentration of tea saponin.The inhibition effect of tea saponin and tea polyphenols and their blends on Escherichia coli was stronger than Staphylococcus aureus.Studies showed that tea saponin and tea polyphenols and their blends had significant antibacterial activities，and the antibacterial effect gradually increased along with their increasing concentration.

tea polyphenols；tea saponin；Staphylococcus aureus；Escherichia coli；inhibition

TS272

A

1002-0306（2014）22-0159-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.026

2014－02－17

晏秀梅（1991-），女，碩士研究生，主要從事茶葉生物化學(xué)和資源利用方面的研究。

* 通訊作者：許靖逸（1980-），女，副教授，主要從事茶葉生物化學(xué)和保健功效方面的科研和教學(xué)。

四川省教育廳青年基金項(xiàng)目（12ZA125）。