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      地被竹與淡竹葉提取物抗氧化活性的比較研究

      2014-03-07 05:53:44倪勤學許光治楊冬冬高前欣張有做
      食品工業(yè)科技 2014年22期
      關鍵詞:鵝毛竹種竹葉

      王 姝,倪勤學,許光治,楊冬冬,高前欣,張有做,*

      (1.浙江農(nóng)林大學,亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江臨安 311300;2.浙江農(nóng)林大學,浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術研究重點實驗室,浙江臨安 311300)

      地被竹與淡竹葉提取物抗氧化活性的比較研究

      王 姝1,2,倪勤學2,許光治2,楊冬冬2,高前欣2,張有做2,*

      (1.浙江農(nóng)林大學,亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地,浙江臨安 311300;2.浙江農(nóng)林大學,浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術研究重點實驗室,浙江臨安 311300)

      以5種地被竹與淡竹葉為材料,采用Folin試劑還原比色法、硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法和DPPH法、ABTS法、FRAP法、Fenton反應法比較其提取物中總酚、總黃酮含量及其抗氧化能力。結(jié)果表明,6種竹葉均含有很高的次生代謝物,其中鵝毛竹葉提取物的提取率最高,為8.70%±0.02%,高于淡竹的提取率(8.02%±0.06%);以干基計算,六種竹子總酚含量在4.13%~9.06%之間,總黃酮含量在2.35%~4.37%之間,其中兩者含量最高的為鵝毛竹;竹葉提取物具有較強清除自由基的作用,清除DPPH自由基和ABTS自由基能力強于淡竹的有鵝毛竹和南平倭竹;不同竹種提取物的鐵還原能力之間存在顯著性差異,強于淡竹的只有鵝毛竹,其FRAP值為585.00μg/mL。

      地被竹,淡竹,竹葉,抗氧化

      竹子是禾本科竹亞科多年生的常綠植物,其次生代謝物非常豐富,現(xiàn)如今在世界上是具有使用價值的物群之一。素有“竹子王國”之稱的中國,擁有豐富的竹資源,特別是在我國長江以南地區(qū),竹子種類、面積和竹材產(chǎn)量都位居前列。目前對竹葉提取物的研究主要集中于剛竹屬的一些竹種,如毛竹、淡竹、斑竹等,其中淡竹竹葉可入藥,這在唐朝著名食療學家孟冼所著《食療本草》中有所記載[1]。大量研究表明,淡竹葉中主要有效成分為黃酮糖苷、香豆素類[2]和茶多酚[3],具有降血脂、抗血栓、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生理活性[4-8]。另外,發(fā)現(xiàn)淡竹葉中還含有多糖類成分、內(nèi)酯、葉綠素、氨基酸、維生素、微量元素等成分,其都具有很高的生物活性作用[9]。然而剛竹屬竹種葉的采集難度大、生物量也相對較小,不利于開發(fā)為葉用竹種;反之,地被竹種因其稈形矮小、葉子密集、葉生物量大,適于機械化采摘。目前對地被竹的研究報道也相對較少。

      本實驗選取5種地被竹和淡竹的竹葉為研究對象,比較研究地被竹與淡竹竹葉中總酚、總黃酮的含量及其抗氧化活性,為地被竹在以后的研究和開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      鵝 毛 竹(Shibataea chinensis Nakai)、南 平 倭 竹(S.nanpingensis Q.F.Zheng et K.F.Huang)、鋪 地 竹(Sasa argenteastriatus Camus)、翠 竹(Sasa pygmaea(Miq.)E.G.Camus)、黃 條 金 剛 竹(Pleioblastus kongosanensis f.aureostriatus Muroi et Yuk.Tanaka)、淡竹(Phyllostachysnigra var.henon) 于2012年8月采集;蘆丁、對羥基苯甲酸、DPPH(2,2’-二苯基-1-苦味酰苯肼)、ABTS 購自Sigma公司,純度均大于98%;福林試劑 購自上海鼎國生物科技有限公司;pUC18質(zhì)粒 DNA(0.5μg/μL) 購自寶生物工程(大連)有限公司;甲醇、乙醇、碳酸鈉、FeCl3、硫酸、雙氧水、FeSO4等 為分析純;水 為去離子水。

      DGG-9053AD型高溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-1800型紫外分光光度計 島津;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司;YP502型電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 樣品制備 分別采集6個竹種的新鮮葉子,清洗瀝干,立刻用微波爐加熱(間隙加熱3次,每次1min),然后置于烘箱中干燥至恒重,粉碎,過40目篩,備用[10]。

      分別稱取5.00g粉末平行樣品3份,加入15倍的甲醇回流提取2h,提取3次,趁熱過濾,洗渣,合并濾液,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀,得到醇提取物(m)。將醇提取物用一定體積的蒸餾水混懸,脫脂,脫脂后用正丁醇溶劑萃取,得到各竹種的正丁醇萃取物,濃縮干燥到恒重(mi),備用。

      提取物得率(%)=mi/5.00×100

      式中,mi指各竹種正丁醇相萃取物的質(zhì)量(g)。

      1.2.2 竹葉提取物中總酚含量的測定

      1.2.2.1 標準曲線的測定 以對羥基苯甲酸為標準品,采用Folin試劑還原比色法[10]測定,在745nm的波長處測定吸光度(A)。以A值為縱坐標(Y),對羥基苯甲酸的質(zhì)量為橫坐標(X),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=0.0309 X+0.0914,R2=0.9966,線性范圍為2~ 9μg/mL。

      1.2.2.2 樣品測定 分別精密量取待測液0.05mL,按標準曲線制備中的方法在745nm處測定A值,并根據(jù)對羥基苯甲酸的標準曲線,計算各試樣的總酚含量。

      總酚含量(%)=(m1×V2)/(m×V1)×100

      式中:m1—依據(jù)標準曲線計算出被測液中總酚含量(mg),m—供試品取樣量(mg),V1—待測液分取的體積(mL),V2—待測液的總體積(mL)。

      1.2.3 竹葉提取物中總黃酮含量的測定

      1.2.3.1 標準曲線的制作 以蘆丁為標準品,參照丁明等[11]的硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法加以改進,準確吸取濃度為150μg/mL的標準品溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL移入10mL具塞試管中,加無水乙醇定容至5mL,分別加入0.3mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置5min,加入0.3mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻,放置6min后加入2mL 1.0mol/L氫氧化鈉溶液,用無水乙醇定容至10mL,靜置10min。在波長510nm處測定A值。以A值為縱坐標(Y),以蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(X),繪制標準曲線,得回歸方程為Y=0.0049X+0.0018,R2=0.9984,線性范圍為30~60μg/mL。

      1.2.3.2 樣品測定 分別精密量取待測液0.1mL,在510nm的波長處測定A值,并根據(jù)蘆丁的標準曲線,計算各試樣的總黃酮含量。

      總黃酮含量(%)=(m1×V2)/(m×V1×106)×100

      式中:m1—依據(jù)標準曲線計算出被測液中黃酮含量(μg),m—供試品取樣量(g),V1—待測液分取的體積(mL),V2—待測液的總體積(mL)。

      1.2.4 竹葉提取物抗氧化活性的測定

      1.2.4.1 清除DPPH自由基實驗 參照文獻[12]方法加以改進,準確稱取DPPH試劑0.01g,用甲醇溶解至250mL量瓶中,定容,搖勻得0.10mmol/L。分別取0.1mL待測樣液和3.9mL DPPH溶液混合搖勻,在室溫下反應1h,517nm波長下測定A值。以甲醇為空白對照,計算各樣品抑制率。

      以待測樣品濃度為橫坐標(X),抑制率為縱坐標(Y)得待測樣品清除DPPH 自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

      抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

      1.2.4.2 清除ABTS+自由基實驗 參照文獻[13]方法加以改進。取176μL濃度為140mmol/L的過硫酸鉀水溶液加入到10mL濃度為0.384mg/mL的ABTS+溶液中混合,避光反應12~16h。

      測定之前加入無水乙醇將ABTS+溶液稀釋至吸光值為0.700±0.02(734nm)下。以無水乙醇為空白試劑將分光光度計調(diào)零。將3.9mL的ABTS+溶液與0.1mL的待測液溶液混合搖勻,在室溫下反應6min,在734nm波長下測定吸光值(A樣品)。3.9mL的ABTS溶液與0.1mL樣品提取劑為空白對照,測得吸光值(A空白)。以待測樣品濃度為橫坐標(X),抑制率為縱坐標(Y)得待測樣品清除ABTS+自由基的關系曲線。計算得到待測樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

      抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

      1.2.4.3 FRAP法分析鐵離子還原能力 參照文獻方法[14],配 制 相 同 濃 度 的 樣 品 溶 液 ,各 取 0.3mL 加 入2.7mL工作液(0.3mo1/L醋酸鹽緩沖液25mL,10mmol/LTPTZ溶 液2.5mL,20mmo1/L FeCl3溶 液2.5mL),混 勻后在37℃反應10min,于593nm處測定A值。以70%乙醇溶液做空白對照。準確量取6.08mg硫酸亞鐵溶于適量的水中,加入18mo1/L硫酸0.25mL,再加水稀釋至50mL,得0.8mmol/L的硫酸亞鐵溶液,并置入小鐵釘。依次配制400、200、100、50、25μmol/L標準溶液,以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(X),A值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,將樣品反應后的A值在標準曲線上獲得相應的硫酸亞鐵的濃度(μmol/L)定義為FRAP值。

      1.2.4.4 對DNA損傷的保護作用的瓊脂糖凝膠電泳檢測法 參照文獻[15]的方法并加以改進,采用Fenton反應法測定竹葉提取物保護DNA損傷的能力。樣品濃度均為10mg/mL,pUC18質(zhì)粒DNA 25μg溶于1mol/L,pH7.4的Tris-HCl緩沖液中,備用。DNA溶液1μL,1.75mmol/L FeSO4溶液2μL,不同的樣品2μL移入離心管,加入200mmol/L H2O2溶液2μL,用去離子水補充至20μL,混合,置于室溫下10min后,直接進行1%瓊脂糖凝膠電泳??瞻讓φ諡?μL DNA溶液和1μL Tris-HCl緩沖液用去離子水補充至20μL。Fenton反 應 對 照 為 1μL DNA 溶 液 、1μL Tris-HCl緩 沖 液 、2μL FeSO4溶液和2μL H2O2溶液,用去離子水補充至20μL。實驗組為1μL DNA溶液、1μL Tris-HCl緩沖液、2μL FeSO4溶液、2μL樣品溶液和2μL H2O2溶液,用去離子水補充至20μL,在瓊脂糖凝膠中加入樣品的順序依次為鵝毛竹、南平倭竹、鋪地竹、翠竹、黃條金剛竹、淡竹。

      1.2.5 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以±s表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 地被竹與淡竹竹葉提取物得率的比較

      地被竹與淡竹竹葉提取物的得率見表1。由表1可知,竹葉提取物的得率存在顯著性差異(p<0.05),從高到低依次為:鵝毛竹>南平倭竹>淡竹>翠竹>黃條金剛竹>鋪地竹,即鵝毛竹的得率最高,為8.68%~8.72%;而鋪地竹的得率最低,為6.82%~6.96%;高于淡竹得率的有2個品種,低于淡竹得率的有3個品種,分別為鋪地竹、翠竹及黃條金剛竹。

      2.2 地被竹與淡竹竹葉中有效成分的含量比較

      以干基計算,地被竹與淡竹竹葉提取物中總酚、總黃酮的含量見表2。由表2可知,不同竹種竹葉提取物中總酚、總黃酮的含量存在顯著性差異(p<0.05),6個竹種相比較,總酚含量的高低順序依次為鵝毛竹>南平倭竹>淡竹>黃條金剛竹>翠竹>鋪地竹,也即鵝毛竹的含量最高,為9.06%±0.02%,鋪地竹最低為4.13%±0.03%,鵝毛竹葉中總酚的含量約為翠竹葉的2倍左右。與淡竹葉相比較,總酚含量高于淡竹葉的有2個竹種,為鵝毛竹和南平倭竹,這與提取率的結(jié)果是一致的。地被竹的竹葉提取物中總黃酮的含量趨勢與總酚含量趨勢基本一致,但與淡竹葉相比,總黃酮含量高于淡竹葉的只有鵝毛竹葉,其含量為4.37%±0.02%,總黃酮含量的高低順序依次為:鵝毛竹>淡竹>南平倭竹>黃條金剛竹>翠竹>鋪地竹。

      2.3 地被竹與淡竹竹葉提取物的抗氧化能力的比較

      地被竹與淡竹葉提取物對DPPH自由基、ABTS自由基的清除效果見表3。由表3可知,各竹種竹葉提取物對DPPH自由基的清除能力存在顯著的差異,但均低于VC的清除能力,其清除能力的大小順序為:VC>鵝毛竹>南平倭竹>淡竹>翠竹>黃條金剛竹>鋪地竹。與淡竹相比,清除DPPH自由基能力最強的地被竹是鵝 毛 竹 ,經(jīng) 計 算 其 半 抑 制 濃 度(IC50)為 32.33μg/mL,其次為南平倭竹,其半抑制濃度為33.50μg/mL,高于淡竹的半抑制濃度(IC50)34.43μg/mL。

      表1 萃取后不同竹種竹葉提取物的得率(n=3)Table 1 The yields of bamboo leaf extracts from different varieties(n=3)

      表2 不同品種竹葉中有效成分的含量(n=3)Table 2 Contents of active component in the bamboo leaves from different species(n=3)

      表3 不同竹種竹葉提取物的抗氧化活性(n=3)Table 3 Anti-oxidant activities in the extract from bamboo leaves of different species(n=3)

      各提取物對ABTS+自由基的清除能力也存在明顯的差異,它們的清除能力也均低于VC清除ABTS+自由基的能力,強弱順序為VC>鵝毛竹>南平倭竹>淡竹>黃條金剛竹>翠竹>鋪地竹,與淡竹相比,地被竹中的鵝毛竹及南平倭竹依然顯示出了較強的清除ABTS+自由基的能力,其半抑制濃度(IC50)分別為5.69、5.92μg/mL,高于淡竹的6.08μg/mL。同時由表3可知,鋪地竹不管是清除DPPH自由基還是清除ABTS+自由基的效果都是最差的。

      表4 不同竹種竹葉提取物的FRAP值(n=3)Table 4 FRAP of the extract from bamboo leaves of different species(n=3)

      2.4 地被竹與淡竹竹葉提取物還原能力的比較

      2.4.1 硫酸亞鐵標準曲線的制備 以硫酸亞鐵濃度為橫坐標(X),吸光值為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得到如圖1所示的一條函數(shù)曲線,對其數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)回歸處理,得到回歸方程為y=0.0007x+0.0515,R2= 0.9981,線性范圍為100~800μmol/mL。

      圖1 硫酸亞鐵標準曲線Fig.1 Standard curve of the FeSO4

      2.4.2 竹葉提取物的FRAP值 根據(jù)標準曲線的回歸方程計算,5種地被竹及淡竹葉提取物的FRAP值測定結(jié)果見表4。由表4可知,不同竹種提取物及VC的鐵還原能力存在顯著性差異(p<0.05)。在所有竹種中,鐵還原能力最強的是鵝毛竹,其FRAP值為(585.00±1.43)μg/mL,與淡竹相比,鐵還原能力高于淡竹的也只有鵝毛竹,其他地被竹的鐵還原能力都弱于淡竹的鐵還原能力,還原能力大小順序依次為鵝毛竹>淡竹>南平倭竹>翠竹>黃條金剛竹>鋪地竹。

      2.5 地被竹與淡竹竹葉提取物對DNA損傷的保護能力的比較

      Fenton反應的原理是在Fe2+的催化作用下,H2O2產(chǎn)生具有高反應活性的羥基自由基,其氧化能力僅次于氟無機氧化劑[16]。在生物體代謝過程中產(chǎn)生的羥基自由基與蛋白質(zhì)交聯(lián)變性,危害人體健康[17]。

      地被竹與淡竹竹葉提取物對DNA損傷的保護能力見圖2,泳道1是Mark,泳道2是空白對照,泳道3是Fenton反應對照,泳道4~泳道9是分別加入相同濃度的鵝毛竹、南平倭竹、鋪地竹、翠竹、黃條金剛竹及淡竹竹葉提取物。由圖1表明,在加入同樣濃度提取物的情況下,鵝毛竹、鋪地竹、黃條金剛竹及淡竹對pUC18質(zhì)粒DNA的保護作用明顯強于南平倭竹和翠竹對DNA的保護能力,由圖2中DNA條帶的亮度可知鵝毛竹的保護作用最強,高于淡竹的保護能力,即鵝毛竹對羥基自由基的清除能力高于淡竹的清除能力。

      2.6 竹葉提取物中總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性

      地被竹與淡竹竹葉提取物中總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性見表5。由表5可知,6個竹種竹葉提取物中總酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間存在很大的相關性,相關性都在90%以上,其中總黃酮含量與ABTS+自由基的清除能力和鐵還原力之間的相關性要高于總酚含量與兩者的相關性,說明,黃酮在清除ABTS+自由基和鐵還原能力上起主要作用。而總酚含量與清除DPPH自由基能力之間的相關性卻大于總黃酮含量與清除DPPH自由基能力之間的相關性,說明,在竹葉提取物中除了總黃酮外還存在其他物質(zhì)具有清除DPPH自由基的能力,這與宋仲容等[18]的研究結(jié)果相一致。

      圖2 各竹種竹葉提取物對DNA損傷的保護Fig.2 Protection of DNA damage in the extract from bamboo leaves of different species

      表5 不同竹種竹葉提取物中總酚、總黃酮與抗氧化活性的相關性Table 5 The correlation between content of the total phenols,total flavonoids and the antioxidant activity in the extracts of different varieties

      3 結(jié)論

      3.1 對5種地被竹和淡竹的測定結(jié)果表明,地被竹竹葉中也含有豐富的次生代謝物,不同地被竹與淡竹竹葉提取物中總酚、總黃酮含量之間存在顯著性差異,其中兩種有效成分均高于淡竹的地被竹只有鵝毛竹,均低于淡竹的地被竹有鋪地竹、翠竹和黃條金剛竹。

      3.2 抗氧化和還原能力的實驗結(jié)果表明地被竹與淡竹竹葉提取物所表現(xiàn)出來的抗氧化能力及鐵還原能力之間也存在顯著性差異。同時,竹葉提取物的抗氧化活性與有效成分含量之間存在很大的相關性,鵝毛竹、南平倭竹的抗氧化能力強于淡竹的抗氧化能力。這可能與鵝毛竹和南平倭竹同屬于倭竹屬有關,還有待進一步研究。

      3.3 竹葉提取物對DNA損傷保護的實驗結(jié)果表明,同濃度提取物的處理下,所有竹種竹葉提取物對DNA的損傷都顯示出了一定的保護作用。鵝毛竹、鋪地竹、黃條金剛竹及淡竹對pUC18質(zhì)粒DNA的保護作用明顯強于南平倭竹和翠竹對DNA的保護能力。因此可推斷,地被竹竹葉提取物對羥基自由基具有一定的清除能力,具有進一步開發(fā)和研究的潛力。

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      Comparative analysis of antioxidant activity of bamboo leaf extracts of ground bamboo and Phyllostachysnigra var.henon

      WANG Shu1,2,NI Qin-xue2,XU Guang-zhi2,YANG Dong-dong2,GAO Qian-xin2,ZHANG You-zuo2,*
      (1.The Nurturing Station of the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,China;2.The key laboratory for quality improvement of agricultural products of Zhejiang province Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,China)

      Six bamboo leaves (five ground bamboos and Phyllostachysnigra var) was used as the materials to analysis the contents of total phenols and total flavonoids by using Forint reduction assay reagent and aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetry and their antioxidant activity by using DPPH ,ABTS , FRAP and Fenton reaction method,respectively.The result showed that six kinds of bamboo leaves contained abundant botanic secondary metabolites.The yield of extract from Shibataea chinensis Nakai was maximum,up to 8.70% ±0.02% ,higher than that of extract from Phyllostachysnigra var.The yield of extract from S.nanpingensis Q.F. Zheng et K.F.Huang was 8.02%±0.06%.The content of total phenolics,on dry basis of leaves,varied in a range of 4.13% ~9.06%in the six kinds of bamboo leaves,total flavonoids located in 2.35% ~4.37% ,respectively. Among the six bamboos,there were more contents of total phenolics and total flavonoids in the extract from Shibataea chinensis Nakai was highest.Meanwhile two species(Shibataea chinensis Nakai and S.nanpingensis Q.F.Zheng et K.F.Huang) revealed the stronger scavenging capacity against DPPH· and ABTS+· than those of any other bamboos.The reducing power in each bamboo leaves were significantly changed ( p < 0.05 ) .The reducing power of Phyllostachysnigra var.henon was only lower than that of Shibataea chinensis Nakai,whose FRAP was 585.00μg/mL.

      ground bamboo;Phyllostachysnigra var.henon;bamboo leaves;anti-oxidant activity

      TS201.1

      A

      1002-0306(2014)22-0135-05

      10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.021

      2014-02-25

      王姝(1988-),女,碩士研究生,研究方向:竹林培育與利用。

      * 通訊作者:張有做(1970-),男,博士,教授,研究方向:食品分子功能學。

      浙江省科技廳公益性項目(2013C32089)。

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