四種北高叢藍莓提取物抗氧化作用的研究

朱 穎，孫曉紅，*，姜文潔，趙 勇，吳啟華，潘迎捷

（1.上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；2.美國緬因大學食品與農(nóng)業(yè)學院，美國緬因州 04469）

四種北高叢藍莓提取物抗氧化作用的研究

朱 穎1，孫曉紅1，*，姜文潔1，趙 勇1，吳啟華2，潘迎捷1

（1.上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；2.美國緬因大學食品與農(nóng)業(yè)學院，美國緬因州 04469）

以四個北高叢藍莓品種的甲醇提取物為研究對象，分別用紫外分光光度計測定總糖、總酚、花青素及黃酮的含量，并利用體外法研究了四種藍莓提取物對DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，同一時期同一地點采摘的藍莓，總糖、總酚、花青素以及黃酮含量最高的是愛國者，它們的值分別為9.77%，1.91mg/g，0.668mg/g，0.22mg/g，其次為北青，含量最低的為尼爾森（除花青素外）。四個品種的藍莓甲醇提取物對DPPH自由基均具有不同程度的清除作用，愛國者和北青的DPPH自由基清除能力較強，能夠達到30%以上，這與其中所含的總酚、花青素的含量呈正相關(guān)。

藍莓，總糖，總酚，花青素，黃酮，抗氧化

藍 莓（Ericaceae Vacinium spp.）又 名 藍 漿 果 、越桔等，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinmum.L）植物，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木[1]。我國現(xiàn)在主要的栽培品種有高叢藍莓、矮叢藍莓和兔眼藍莓，主要分布在東北地區(qū)、山東、內(nèi)蒙古等地。據(jù)科學研究發(fā)現(xiàn)，藍莓果實具有防止腦神經(jīng)衰老、增強心臟功能、明目抗癌等獨特功效。因此，藍莓被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）確定為人類五大健康食品之一[2]，也被稱為繼蘋果和柑桔之后的“世界第三代水果”。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部人類營養(yǎng)研究中心稱，藍莓是所研究過的40多種果蔬中抗氧化成分最豐富的一種[3]。它除了含有熟知的維生素C、維生素E、番茄紅素、類胡蘿卜素等有抗氧化營養(yǎng)素以外，還含有豐富的多酚類等物質(zhì)，包括花青素、黃酮等，因此具有更高的抗氧化性[4]。

由各種氧自由基引發(fā)的氧化作用，是導致身體各組分和器官損傷、病變的重要原因之一。而人體內(nèi)的各種內(nèi)源性抗氧化物（比如VC、VE、輔酶Q、SOD等）是防御自由基氧化脅迫的第一道防線，當它們防御能力減弱的時，就需要從食品中去補充外源性抗氧化物（比如多酚、類黃酮、花色素苷等）來有效地阻斷和消除各種氧化損傷，使得機體保持健康狀態(tài)，延緩衰老。藍莓具備的高抗氧化能力已經(jīng)被大家熟知，這是由于它富含花青素以及其他多酚類物質(zhì)。

近年來，國內(nèi)外學者對藍莓的活性成分以及功能進行了研究。國外Xianli Wu[5]用藍莓和木莓的提取液進行了人體的實驗，實驗結(jié)果表明：花青素對于尿道感染發(fā)炎作用有很好的保護和預防作用。Fitzpatrick[6]的研究表明原花青素具有血管舒張效應，可以預防一些慢性疾病。Alison Lacombe[7]用蔓越莓的粉末進行了成分的提取，從中分離出了花青素、酚類物質(zhì)、有機酸等，用這些活性成分做了抑菌研究。Wilms[8]實驗證明女性志愿者服用富含槲皮素的藍莓蘋果汁可以保護人類淋巴細胞的DNA不被過氧化氫破壞，而用以說明其具有抗癌與抗氧化作用。Matchett[9]發(fā)現(xiàn)矮叢藍莓所含的黃酮類物質(zhì)可以抑制前列腺癌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶，證明黃酮類物質(zhì)具有很好的抗癌作用。國內(nèi)劉文旭等[10]測定了草莓、藍莓、黑莓中多酚類物質(zhì)的抗氧化活性，結(jié)果表明總酚含量與抗氧化能力之間顯著性相關(guān)。劉翼翔[11]以野生藍莓為研究材料，分析了其中總酚、花色苷及維生素C等功能成分的含量，研究了其抑制細胞氧化損傷的功能，結(jié)果表明多酚類物質(zhì)有良好的抗氧化活性，而除花色苷外，酚酸也是藍莓中的主要抗氧化活性物質(zhì)。王靜[12]用大孔樹脂對藍莓中的花青素進行純化，并通過小鼠受熱致痛法等來研究藍莓花青素的鎮(zhèn)痛和抗炎作用效果。實驗證實純化后的花青素可提高小鼠痛閾、抑制耳廓腫脹，具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。陳健[13]用 甲 醇 提 取 藍 莓 中 的 花 青 素 并 進 行 純 化 ，用DPPH法測定其抗氧化能力，結(jié)果顯示，花青素有較好的清除DPPH自由基的能力。劉小莉[14]用微波萃取藍莓葉中的總黃酮，并用DPPH法測定提取物清除自由基的能力，與陽性對照二丁基羥基甲苯和抗壞血酸進行比較，結(jié)果顯示藍莓葉提取物具有良好的抗氧化活性。

以前藍莓種植戶只是改善果實的大小、果實的產(chǎn)量、果實的顏色以及果實的味道，而現(xiàn)在更關(guān)注的是藍莓的營養(yǎng)價值，選擇營養(yǎng)價值高抗氧化能力強的品種去進行培育。本實驗選用化學分析法測定了同一地區(qū)的四個北高叢藍莓品種甲醇提取物的總糖、總酚、花青素和黃酮的含量，并對其清除DPPH自由基的能力做了研究，通過比較同一地區(qū)不同品種的成分含量及抗氧化能力的大小，為藍莓品種的栽培及果實的綜合開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 藍豐（Bluecrop）、北青（Northblue）、愛國者（Patriot）、尼爾森（Nelson）四種北高叢藍莓果實購自青島沃林農(nóng)業(yè)有限公司，-20℃冷凍儲藏備用；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、福林酚、乙醇、甲醇、甲酸、濃硫酸、氯化鉀、醋酸鈉、苯酚、硝酸鋁、碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼） Sigma公司：所有試劑 均為分析純。

8010s組織勻漿機Waring Commerial；pl2002電子天平MettlerToledo；SK5200HP超聲波清洗機 上?？茖С暡▋x器有限公司；GG17旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

SENCO；TDZ5-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SHB-3循環(huán)水真空泵 上海申生科技有限公司；TU-1810紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓甲醇提取物的制備[5]將四種藍莓凍果取出，解凍，組織勻漿機勻漿，稱取20g勻漿用20mL含0.5%甲酸的85%甲醇溶液進行提取，再進行超聲波處理10min，然后靜置10min，靜置完畢后4550g離心10min，取上清液至燒杯。沉淀繼續(xù)按上述步驟進行提取，使得成分充分浸提。每次的上清液混合進行45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45min至甲醇甲酸揮發(fā)完全蒸干，加入10mL蒸餾水，濃縮至2g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藍莓提取物總糖含量的測定方法 總糖含量的測定采用GB/T 5009.7-2008方法并加以改進，以蔗糖溶液為標準物。取6支25mL刻度試管（重復做兩組），加入100μg/L蔗糖標準液，用蒸餾水補足至2mL。按順序向試管內(nèi)加入1.0mL 0.09g/mL苯酚溶液搖勻，再從管液正面在5~20s內(nèi)加入5mL濃硫酸，搖勻?；旌弦嚎傮w積為8mL，在室溫下放置30min中進行反應。然后以空白為參照，在485nm處進行比色測定吸光度值。以蔗糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，求出線性回歸方程，由回歸方程得到提取物中總糖含量?？偺菧y定標準曲線見圖1。

圖1 藍莓總糖測定的標準曲線Fig.1 Standard curve of blueberry total sugar

樣品的測定：準確吸取適當稀釋倍數(shù)的測試樣品0.5mL于試管中，再按上述步驟操作，測定樣品的吸光度，以標準曲線計算總糖含量。

結(jié)果計算：根據(jù)顯色液吸光度值，在標曲上查出相應的蔗糖質(zhì)量，按下式計算總糖含量，以質(zhì)量分數(shù)（%）表示。

式中：m′：從標準曲線中查得的蔗糖質(zhì)量，μg；V：樣品提取液總體積，mL；N：樣品提取液稀釋倍數(shù)；V2：測定時所取樣品提取液體積，mL；m：樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 藍莓提取物總酚含量的測定 根據(jù)García[15]方法進行改進，以沒食子酸為標準物。準確稱取沒食子酸標準品0.050g，用超純水配制成0.1mg/mL的沒食子酸標準溶液。準確移取沒食子酸標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于5mL容量瓶中，分別用超純水補足至1.0mL，再加入0.4mL福林酚（FC）試劑，0.8mL質(zhì)量分數(shù)10%的Na2CO3飽和溶液，充分混勻后用水定容至5mL，室溫下靜置2h，隨后于770nm波長處測定吸光度。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖2。

準確吸取一定濃度的待測樣品提取液100μL，水補足至1.0mL。測定步驟與繪制標準曲線相同，按順序加入福林酚試劑、Na2CO3飽和溶液，顯色并測定吸光度值。待測液中總酚含量以每克樣品相當于沒食子酸的毫克數(shù)表示。

圖2 藍莓總酚測定的標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

1.2.4 藍莓提取物花青素含量的測定 花青素的含量 用pH示 差 法 進 行 測 定[16]。 取 藍 莓 粗 提 液1mL，加入 pH4.5 的 0.4mol/L 的 醋 酸 鈉 緩 沖 液 或 pH1.0 的0.025mol/L氯化鉀緩沖液4mL，搖勻，分別在520nm和700nm為吸收波長測定其吸光度值。藍莓提取液的花青素的濃度按下式計算：

花青素濃度（mg/L）=A/ε×1000×MW×DF

式中：A為最終吸光度，A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；ε：摩爾吸光系數(shù)，以矢車菊定-3-葡萄糖苷的摩爾系數(shù)進行計算，為26900；MW為矢車菊定-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，為449.2；DF是稀釋倍數(shù)；藍莓提取物中花青素含量最終以1g試樣中含有花青素的量（mg）來表示。

1.2.5 藍莓提取物黃酮含量的測定 黃酮含量采用張 東 升[17]中 NaNO3-Al（NO3）3法 進 行 測 定 ，標 準 曲 線見圖3。黃酮含量以每克樣品中相當于蘆丁的毫克數(shù)表示。

1.2.6 清除DPPH自由基的測定 參照Ilhami Gulc等[18]的方法進行改進。無水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。用溶劑將樣品稀釋1000倍，待測。將反應體系充分混勻，室溫下避光靜置30min。反應結(jié)束后，在517nm處測定吸光度值。按照表1進行實驗：

圖3 藍莓黃酮測定的標準曲線Fig.3 Standard curve of flavonoid

表1 DPPH實驗加樣表Table 1 Test sample table of DPPH

按下列公式進行清除率的計算：

式中：A0為未加提取液的DPPH溶液的吸光度，以無水乙醇作空白；A1為加入提取液后DPPH溶液的吸光度，以無水乙醇作空白；A2為提取液與乙醇混合后的吸光度，以無水乙醇作空白。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 每個實驗重復三次，取平均值，用SPSS Statistics20.0處理數(shù)據(jù)得出差異（p＜0.05）以及用Origin9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種北高叢藍莓提取物的總糖含量

總糖含量是所有糖的總和，包括可溶性糖、大部分單糖和簡單的二糖。果實中總糖含量能反映出果實的成熟度和品質(zhì)狀況，能影響藍莓的口味，因此總糖含量可作為評價藍莓果實品質(zhì)的指標之一。從表3可見四種藍莓的總糖含量在6%~10%之間，存在顯著差異性（p＜0.05），其中愛國者的總糖含量最高，接近10%。

表2 藍莓提取物的總糖含量Table 2 Tte total sugar content of blueberry extracts

2.2 四種北高叢藍莓提取物的總酚含量

酚類化合物是廣泛存在于水果、蔬菜和谷類食物中的植物次生代謝物，是極好的氫供體和電子供體。由于形成的酚類自由基中間體的共振非定域作用以及沒有適合分子氧進攻的位置，比較穩(wěn)定，不會引發(fā)新的自由基或自由基鏈反應而被迅速氧化，因此是很好的抗氧化劑。除此之外，它還有其他的生物活性，尤其在預防心腦血管疾病、癌癥以及抗炎癥方面發(fā)揮著十分重要的作用。由圖4可知，四種藍莓甲醇提取物中總酚含量存在一定的差異性（p＜0.05），說明在同一地區(qū)栽培方式相同的情況下，品種之間存在差異性。其中愛國者、北青總酚含量比藍豐、尼爾森的高，愛國者的總酚含量最高，以沒食子酸來計達到1.91mg。

圖4 四種藍莓品種的總酚含量Fig.4 The total phenolic content of four blueberry varieties

2.3 四種北高叢藍莓提取物的花青素含量

花青素是水溶性單體色素，在植物中常見的有6種，即飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?、天竺葵色素、牽牛花色素和錦葵色素。在自然狀態(tài)下游離的花青素很少見，常與葡萄糖、半乳糖、木糖等通過糖苷鍵形成花色苷。有研究表明：花青素是至今為止所發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑，其淬滅自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍[19]。pH示差法測定了4個北高叢藍莓品種的花青素總含量，以矢車菊定-3-葡萄糖苷為對照計算，結(jié)果如圖5。愛國者花青素相對含量最高，達到了0.668mg/g（FW），藍豐含量最低，僅為0.127mg/g（FW）。四個藍莓品種中花青素含量之間存在著顯著差異性（p＜0.05）。

圖5 不同藍莓品種花青素含量Fig.5 Contents of anthocyanin of different blueberry cultivars

2.4 四種北高叢藍莓提取物的黃酮含量

黃酮類化合物廣泛存在于植物的各個部分，大部分是植物的花、果、葉、莖、皮及根中。很多研究表明黃酮類化合物具有顯著的生理藥理活性，它能夠保護人體免受自由基的損傷，增強血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)，增強免疫力，延緩衰老、抵抗心血管疾病等[20]。由圖6可知，愛國者總黃酮含量顯著高于其他三個品種（p＜0.05），高達（0.22±0.11）mg/g，其次為北青（0.16±0.03）mg/g，藍豐和尼爾森總黃酮含量無顯著差異。

圖6 不同品種北高叢藍莓黃酮含量Fig.6 Contents of flavonoids of different north highbush blueberry cultivars

2.5 藍莓甲醇提取物對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一種十分穩(wěn)定的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自于共振穩(wěn)定作用及三個苯環(huán)的空間障礙，使其中氮原子上的不成對電子不能發(fā)揮其應有的電子配對而使吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系。從圖7中可以看出，北青與愛國者清除DPPH自由基的能力顯著強于藍豐和奧尼爾。

圖7 四種藍莓對DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging DPPH free radical’s abilities of four different blueberry cutivars

2.6 藍莓提取物中總酚、花青素含量與DPPH自由基清除能力的相關(guān)性

藍莓不同品種的清除DPPH自由基的能力不同，這可能與其中多酚含量、花青素含量有關(guān)，需將多酚含量、花青素含量與DPPH自由基清除率做相關(guān)分析，從而得出其相關(guān)性。由圖8可知，藍莓甲醇提取物的DPPH自由基的清除能力與其總酚含量、花青素含量之間存在一定線性關(guān)系，清除能力與總酚含量的相關(guān)系數(shù)為0.9346（R2=0.8735），與花青素含量的相關(guān)系數(shù)是0.9280（R2=0.8611），說明DPPH清除能力與其總酚含量、花青素含量存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，其中與總酚含量的相關(guān)性最好，表明藍莓的抗氧化能力與其酚類物質(zhì)的含量有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究對四種藍莓總糖、總酚、花青素、黃酮含量及DPPH自由基清除能力進行分析，結(jié)果表明各個品種之間存在著顯著的差異性。愛國者總糖含量為9.77%，總 酚 含 量 達 到1.91mg/g，花 青 素 為 0.668mg/g（FW），黃酮含量為0.22mg/g，為四種藍莓中含量最高。清除DPPH自由基能力最強的品種是北青，從品種的抗氧化能力來評判，種植者可以選擇北青這一品種進行栽植，作為高端產(chǎn)品的一個選擇。

圖8 總酚、花青素含量對DPPH自由基清除能力的相關(guān)性Fig.8 Correlation between total contents of phenolics，anthocyanins and DPPH free radical’s scavenge abilities

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Study on the antioxidant ability of four varieties of Northern highbush blueberry extracts

ZHU Ying1，SUN Xiao-hong1，*，JIANG Wen-jie1，ZHAO Yong1，Vivian C.H.Wu2，PAN Ying-jie1
（1.Collage of Food Science ＆ Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；2.School of Food and Agriculture，University of Maine，ME 04469-5735，USA）

The total sugar content，total phenolic content，total anthocyanins content and total flavonoids content of four kinds of highbush blueberries methanol extracts were determined through UV-spectrophotometer method.The scavenging DPPH free radical ability of four kinds of blueberries extracts were investigated by in vitro assay.The results demonstrated that Pariot had the highest contents of sugar，phenolics，anthocyanins and flavonoids among the four blueberry cultivars collected at the same time and place ，and the value was 9.77% ，1.91mg/g，0.668mg/g and 0.22mg/g respectively.Nelson had the lowest contents of sugar，phenolics，anthocyanins and flavonoids.The four kinds of methanol extracts of blueberries showed different scavenging abilities against DPPH free radicals.Paroit and Northblue had better DPPH free radical scavenging ability，the value could reach above 30%and the positive correlation among the antioxidant capacity and the content of phenolics，anthocyanins were observed.

blueberry；total sugar；total phenolic；anthocyanin；flavonoid；antioxidant

TS201.4

A

1002-0306（2014）22-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.018

2014－03－13

朱穎（1989-），女，碩士研究生，研究方向：功能食品的開發(fā)與利用。

* 通訊作者：孫曉紅（1979-），女，博士，副教授，研究方向：食品安全與食品微生物。

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號）；上海海洋大學科技發(fā)展專項基金（A2-0209-14-200061）；上海市科委工程中心建設（11DZ2280300）。