中紅外光譜法快速測(cè)定牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)

李巧玲，劉 峰，宋思遠(yuǎn)，李劭彤，李朝陽(yáng)，張二琴

（1．河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2．河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018）

中紅外光譜法快速測(cè)定牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)

李巧玲1，劉 峰1，宋思遠(yuǎn)1，李劭彤1，李朝陽(yáng)2，張二琴2

（1．河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2．河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018）

建立了一種用紅外光譜法檢測(cè)牛乳中摻有非蛋白氮類物質(zhì)的方法。往牛奶中添加不同含量的尿素和三聚氰胺，通過扣除水背景和牛奶背景等不同方法，利用Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀獲取非蛋白氮類物質(zhì)的光譜，找出摻假物質(zhì)的特征峰。將不同MATLAB程序分別同摻假物質(zhì)特征峰的波數(shù)和特征峰的吸光度值或峰面積相結(jié)合，可以對(duì)牛乳中是否摻有非蛋白氮類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，其判別正確率為95.49%，相對(duì)誤差在2%以內(nèi)。該方法快速、簡(jiǎn)便易行，適用于多種非蛋白類摻假物質(zhì)的檢測(cè)。

牛乳，非蛋白氮，摻假，中紅外光譜法，檢測(cè)

牛奶是自然界給予人類最接近于人乳的天然食品之一，有“白色血液”之稱[1]。由于牛奶的鈣磷比例恰到好處，所以非常有利于其中鈣質(zhì)的吸收，是人體鈣的最佳來源之一。然而隨著我國(guó)乳制品行業(yè)的發(fā)展，在利益鏈條的推動(dòng)下，一些唯利是圖的商家不顧消費(fèi)者安危，為了提高牛乳中蛋白質(zhì)的含量，經(jīng)常向牛乳中摻假?！叭矍璋贰焙汀捌じ锶椤钡仁录?，對(duì)人們的日常生活產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，因此，研究一種快速、便捷、適用于多種摻假物質(zhì)的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法[2]主要有：凱氏定氮法[3]、分光光度法[3-4]、杜馬斯燃燒法[5]、高效液相色譜法[6]、電泳法[7]及近紅外光譜法[8-9]等。在這些方法中，凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法的最大局限在于無法區(qū)分樣品中的蛋白氮和非蛋白質(zhì)氮；而其他大多數(shù)方法主要是只能有針對(duì)性的檢測(cè)食品中蛋白質(zhì)的含量，而對(duì)于牛乳中添加了哪種摻偽物均不能給出準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究以牛奶為原料，將得到的測(cè)量樣本的中紅外光譜圖通過扣除水背景、純牛奶背景等處理后，通過Matlab程序結(jié)合測(cè)量樣本的相關(guān)數(shù)據(jù)，以各種含氮化合物的特征吸收峰的位置、吸光度值或峰面積作為判定依據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛乳中摻偽物的定性和定量測(cè)定，探索牛乳中非蛋白氮類物質(zhì)快速檢測(cè)的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶 購(gòu)自超市和市場(chǎng)；尿素 標(biāo)準(zhǔn)品，上海時(shí)代生物科技有限公司；硝酸鈉 分析純，天津市博迪化工股份有限公司；三聚氰胺 標(biāo)準(zhǔn)品，河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供；溴化鉀 光譜純，天津博君科技有限公司。

Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)熱電尼高力儀器公司；YP-2型壓片機(jī) 上海山岳科學(xué)儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；WS70-1型紅外線快速干燥箱 杭州藍(lán)天儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品采集紅外光譜前的預(yù)處理 將溴化鉀烘干，置于紅外線快速干燥箱中備用。稱取標(biāo)準(zhǔn)品約1mg，溴化鉀約150mg，放于瑪瑙研缽中進(jìn)行研磨，將研磨好的粉末進(jìn)行壓片和檢測(cè)。為避免背景對(duì)紅外光譜的影響，設(shè)置儀器在每次采集樣品光譜前先采集一次背景光譜。

1.2.2 溶液的配制 尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用萬分之一的電子天平分別稱取不同量的尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入牛乳中，配制成含尿素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20、25mg/mL的10種的牛乳溶液。用漩渦混合器振蕩10～20min，使尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在液態(tài)乳中充分溶解、混勻。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別配制成含三聚氰胺濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的8種牛乳溶液，所有操作按尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法。

1.2.3 紅外測(cè)定方法和條件 液態(tài)樣品和固態(tài)標(biāo)品分別采用衰減全反射（ATR）附件和溴化鉀壓片法分別采集中紅外光譜圖。按下列條件進(jìn)行掃描：波數(shù)范圍：4000~400cm-1；掃描次數(shù)：256次；分辨率：8cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)用原料牛奶的確定

本實(shí)驗(yàn)為了避免不同品牌牛奶之間存在差異，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而購(gòu)買了蒙牛全脂純牛奶和伊利純牛奶及散裝牛奶進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，所有牛奶樣品均經(jīng)過混勻處理。實(shí)驗(yàn)用ATR附件測(cè)量三種牛奶的中紅外光譜，每種牛奶掃描五次取平均值。三種牛奶的中紅外光譜如圖1所示。從圖1中可以看出，三種牛奶在中紅外光譜圖的出峰位置及走勢(shì)基本相同，但是吸收峰的強(qiáng)度稍有差異。這主要與牛奶的成分及測(cè)量背景差異等方面有關(guān)。而且通過多次掃描也發(fā)現(xiàn)散裝牛奶不如品牌牛奶穩(wěn)定?？紤]到實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，也避免不同品牌牛奶的差異性，實(shí)驗(yàn)選擇同一品牌并且是同一批次的牛奶樣品，即蒙牛全脂純牛奶作為實(shí)驗(yàn)樣品[10]。

圖1 不同牛奶的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of different milk

2.2 牛奶中摻入非蛋白氮物質(zhì)含量的確定

考慮現(xiàn)實(shí)摻假情況，假設(shè)摻假牛奶中的含氮物質(zhì)全由摻假藥品提供，摻入牛奶樣品的摻偽物的含氮量應(yīng)以不超過正常牛奶的蛋白質(zhì)中的含氮量為宜（市售正常牛奶的蛋白質(zhì)含量在4%以下）。因每種摻假物質(zhì)的含氮量不同，計(jì)算后尿素和三聚氰胺摻入牛奶中的濃度如1.2.2所示。尿素雖含氮量高，添加14mg/mL左右即會(huì)超過4%的含氮量，但考慮到實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析等方面的需要，為其多設(shè)置了幾個(gè)濃度梯度。三聚氰胺在水中的溶解度為0.33g/100mL所以三聚氰胺摻入牛奶中的最高濃度為3.3mg/mL[10]。

2.3 牛奶中摻入尿素的紅外光譜圖

將配制好的含尿素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20mg/mL和25mg/mL的10種的牛乳溶液，采用ATR附件測(cè)量樣品4000~800cm-1波數(shù)的中紅外光譜。每個(gè)濃度的樣品掃描十次，其中五次為扣除水背景，五次為扣除牛奶背景。用樣品光譜扣除水背景和牛奶背景光譜，是為了消除儀器漂移的影響，以便于更明顯的看出摻雜物質(zhì)的特征峰。

圖2是摻入各濃度尿素的牛奶樣品的中紅外光譜圖，其中圖2a是扣除水背景后的中紅外光譜圖，可以看出與圖1牛奶的中紅外光譜圖吸收峰的大致位置及形狀是相同的。由特征峰放大（圖2b）明顯發(fā)現(xiàn)在1628cm-1和1463cm-1附近摻雜樣品有不同于純牛奶紅外光譜的特征吸收峰，這與尿素的標(biāo)準(zhǔn)透射中紅外光譜圖（圖2c）的吸收峰位置基本吻合[10]，并且隨著尿素濃度的增加，該特征峰的峰高及峰面積都隨之增加。

圖2d為扣除牛奶背景后得到的中紅外光譜圖。由圖2d可以看出，摻雜尿素的牛奶樣品在1626、1597、1468cm-1位置有吸收峰。其中，1626cm-1處的峰是由尿素中酰胺基中C=O的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，1597cm-1處的峰是由N-H鍵的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，1468cm-1處的峰是由C-N鍵伸縮振動(dòng)引起的。在扣除水背景光譜中不能顯示的吸收峰，在扣除牛奶背景下都有所顯示。且都與各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)透射紅外光譜圖的吸收峰位置吻合，因此這些吸收峰可以作為特征峰，成為判定摻假物質(zhì)的依據(jù)。

2.4 牛奶中摻入三聚氰胺的紅外光譜圖

將配制好的含三聚氰胺濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的8種牛乳溶液，進(jìn)行中紅外光譜掃描。每個(gè)濃度的樣品掃描十次，其中五次為扣除水背景，五次為扣除牛奶背景。圖3是摻入各濃度三聚氰胺的牛奶樣品的中紅外光譜圖，其中圖3a是扣除水背景后的中紅外光譜圖，圖3b為圖3a部分區(qū)域的放大圖，由此圖可以看出摻假樣品在1630cm-1、1552cm-1以及1461cm-1左右有不同于純牛奶紅外光譜的特征吸收峰，這與三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)透射中紅外光譜圖（圖3c）的吸收峰位置類似。但是這三個(gè)位置的特征峰都不明顯，原因可能是由于加入牛奶中的三聚氰胺的濃度較小，紅外光譜的靈敏度較低，因此將此部分區(qū)域進(jìn)行放大后與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)照。圖3d顯示摻雜三聚氰胺的牛奶樣品在1623cm-1，1556cm-1以及1463cm-1三個(gè)位置有吸收峰[10]。其中，1623cm-1處的吸收峰是由三聚氰胺中N-H鍵的彎曲振動(dòng)引起的，1556cm-1和1463cm-1處的吸收峰是由苯環(huán)的伸縮振動(dòng)引起的。

圖2 不同尿素含量的牛奶樣品的中紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of different content urea in milk

圖3 不同三聚氰胺含量的牛奶樣品的中紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of different content melamine in milk

以上分析可以說明，扣除背景光譜的方法可以從復(fù)雜的光譜中提取有用信息，通過比較光譜的吸收峰位置，可以有效判別牛奶中是否摻雜異物。對(duì)于一個(gè)未知樣品，可以測(cè)得其中紅外光譜，扣除背景后，將其吸收峰位置與各摻假物質(zhì)特征峰位置進(jìn)行比對(duì)，可初步判定具體摻入的物質(zhì)。

2.5 牛奶中摻入的非蛋白氮類物質(zhì)的快速檢測(cè)

通過自行編寫的MATLAB程序1結(jié)合圖2和圖3的相關(guān)數(shù)據(jù)，以尿素和三聚氰胺的特征吸收峰位置作為判定依據(jù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中摻入的尿素和三聚氰胺的定性測(cè)定；通過自行編寫的MATLAB程序2結(jié)合圖2和圖3的相關(guān)數(shù)據(jù)，以尿素在1626cm-1和1597cm-1處的雙頭峰，三聚氰胺在1556cm-1處的特征峰的吸光度值或峰面積作為依據(jù)，得到尿素和三聚氰胺的濃度與吸光度值或峰面積的擬合曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)液態(tài)乳中摻入的尿素的定量測(cè)定[1]。其中對(duì)摻入牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)濃度在2mg/mL及以上的樣品的判別正確率達(dá)到95.49%，相對(duì)誤差在2%以內(nèi)[10]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的鑒別牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)的檢測(cè)方法。該方法應(yīng)用中紅外光譜技術(shù)，以牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)作為研究對(duì)象，通過扣除水背景和牛奶背景等不同方法，得到非蛋白氮類物質(zhì)的特征峰，利用自行編寫的MATLAB程序可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)的定性定量分析，該方法對(duì)摻入牛奶中非蛋白氮類物質(zhì)的樣品的判別正確率達(dá)到95.49%，相對(duì)誤差在2%以內(nèi)。

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Fast determination of nonprotein nitrogen content in milk based on mid-infrared spectroscopy method

LI Qiao-ling1，LIU Feng1，SONG Si-yuan1，LI Shao-tong1，LI Zhao-yang2，ZHANG Er-qin2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.College of Sciences，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

A method for detection of adulteration in milk containing nonprotein nitrogen by infrared spectroscopy was established.Through adulterating different content of urea and melamine into pure milk，the infrared spectral data of the samples were obtained by the Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer，followed by water background correction and milk background correction to carry on processing the spectrum data，the characteristic peaks of urea and melamine were obtained.Combining the different MATLAB program with the wavenumber，the absorbance value or the peak area of characteristic peaks，the adulterants in milk could be judged.The method could be used for quantitative and qualitative analysis of adulterants.The correct recognition rate was 95.49%，the relative error was within 2%.This method was fast，simple and suitable for determination of different nonprotein nitrogen.

milk；nonprotein nitrogen；adulteration；mid-infrared spectroscopy；determination

TS252.7

A

1002-0306（2014）22-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.007

2014－02－25

李巧玲（1973-），女，博士，教授，研究方向：食品安全與檢測(cè)。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD29B04-1-1）；河北省科技支撐項(xiàng)目（12220402D）。