重組人粒細胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠大腦皮質蛋白質的影響

劉寶華，沙瑩，白光輝，李勇，鄔偉，商萍，王小同

（1．溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復中心，浙江 溫州 325027；2.吉林大學第一醫(yī)院 干部病房，吉林長春 130021；3.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 影像科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經內科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

重組人粒細胞集落刺激因子對腦缺血再灌注大鼠大腦皮質蛋白質的影響

劉寶華1，沙瑩2，白光輝3，李勇4，鄔偉4，商萍1，王小同1

（1．溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復中心，浙江 溫州 325027；2.吉林大學第一醫(yī)院 干部病房，吉林長春 130021；3.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 影像科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 神經內科，浙江 溫州 325027）

目的：研究造血干細胞動員劑重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）對腦缺血神經系統(tǒng)具有保護作用的蛋白質組學機制。方法：本實驗利用腦缺血再灌注大鼠模型（tMCAO模型）在再灌注2 h后頸部皮下注射rhG-CSF，在灌注后14 d提取大腦皮質蛋白進行雙向電泳。結果：缺血再灌注損傷（模型組）大鼠與假手術組大鼠比較，篩選到56個差異表達蛋白質點，其中17個上調，39個下調，應用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）得到肽質量指紋圖，輸入美國國立生物技術信息中心（NCBI）蛋白質數(shù)據(jù)庫進行檢索，并在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中進一步驗證，鑒定出其中19個為已知蛋白質。而經過人粒細胞集落刺激因子（G-CSF）治療（G-CSF治療組）大鼠與模型組大鼠比較，篩選出35個蛋白質點，其中16個下調，19個上調，其中鑒定為已知蛋白質的有6個，分別為二氫嘧啶酶相關蛋白2、膠質纖維酸性蛋白、內皮黏蛋白、Rho GDP解離抑制因子、Rab GDP解離抑制因子、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白。結論：腦缺血后大鼠腦組織蛋白質表達發(fā)生變化，G-CSF在腦缺血亞急性期可能通過調節(jié)多種神經再生相關蛋白質的表達，參與保護腦缺血的神經元。

粒細胞集落刺激因子；腦缺血；蛋白質組；神經再生；大鼠

重組人粒細胞集落刺激因子（recombinate human granulocyte colony-stimulating factor，rhGCSF）具有促進粒細胞增殖分化，增加外周血中粒細胞的數(shù)目和功能，動員造血干細胞進入到外周循環(huán)的功能[1]，臨床已應用于骨髓移植[2]、粒細胞減少癥[3]及感染性疾病[4]的治療。研究證實粒細胞集落刺激因子（G-CSF）可以保護缺血腦組織[5-6]，應用G-CSF治療的局灶性腦缺血大鼠腦梗死面積明顯降低、存活率增加[7]，其可能通過抗凋亡、抗炎、促進血管神經發(fā)生、動員造血干細胞入腦等多種途徑發(fā)揮作用[8]，但具體作用機制尚未完全明確。因此，本實驗應用蛋白質組學的方法，進一步在蛋白質水平探索rhG-CSF保護腦缺血神經組織的作用機制，為rhG-CSF更好地應用于缺血性腦血管疾病的臨床治療，提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康8～10周齡雄性SD大鼠24只，體質量220～250 g，由吉林大學實驗動物中心提供，室溫分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，隨機分為假手術大鼠（假手術組）8只，右側大腦缺血再灌注損傷大鼠（模型組）8只，腦缺血再灌注后經rhG-CSF干預治療的大鼠（G-CSF治療組）8只，各組間暴露因素無差異。實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物及主要儀器 rhG-CSF（國藥準字S2006 3034），由長春金磊藥業(yè)有限責任公司提供。等電聚焦儀（美國Amersham Biosciences公司），Image Scanner光學掃描儀（瑞典Pharmacia Biotech公司），Ettan picker斑點切膠儀（美國Amersham Biosciences公司，Pittsburgh，Pennsylvania），Ettan digester酶切儀（美國Amersham Biosciences公司），基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOFMS，美國Amersham Biosciences公司）。

1.3 模型制作方法 根據(jù)Hayashi等[9]的方法建立大鼠短暫性大腦中動脈栓塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型（腦缺血再灌注模型）。大鼠用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，頸部腹側正中皮膚切口，分離出右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內動脈（ICA），結扎ECA遠端后，在近端插入直徑約0.5 mm鈍頭尼龍線，經ICA到達大腦中動脈起始部。阻斷右側大腦中動脈，90 min后，把尼龍線拔出、ECA結扎，逐層縫合切口。模型建立后3 d內給予慶大霉素20 000 U腹腔注射。大鼠清醒后參照Longa等[10]的方法進行神經功能評定：0分，無神經缺損；1分，不能伸展對側前肢；2分，向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側跌倒；4分，意識喪失，不能自發(fā)行走。0分和4分動物剔除出實驗。假手術組栓線僅進入ICA起始處，其余步驟相同。C-CSF治療組在再灌注2 h后給予rhG-CSF 50μg·kg-1·d-1[11]，連續(xù)5 d，頸部皮下注射，假手術組與模型組予相同方法皮下注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。各組均在再灌注后14 d時斷頭處死，冰上剝離缺血側（右側）大腦皮層。

1.4 蛋白質樣本制備與定量 將各組右側大腦皮質與液氮混合，在研缽中磨制成粉末，加入已預冷的玻璃勻漿器中，按1∶3.5比例加入樣品裂解液{2 mol/L硫脲、7 mol/L尿素、40 mmol/L Tris-base、二硫蘇糖醇、4% 3-[（3-膽酰胺丙基）-乙二胺]-1-丙磺酸CHAPS、10 mmol/L二硫蘇糖醇、1 mmol/L苯甲基磺酰氟、1 mmol/L EDTA}后放在4 ℃冰浴中勻漿，以150 000×g超速離心60 min；吸取上清液，再以40 000×g離心45 min，用Bradford[12]的方法測定蛋白質濃度，分裝于-80 ℃保存。

1.5 蛋白質雙向凝膠電泳 第一向為固相pH等電聚焦電泳，選17 cm固相pH梯度干膠條（pH 3～10，NL），采用膠內泡脹法，樣品和再水化液{8 mol/L尿素、2%（W/V）3-[（3-膽酰胺丙基）-乙二胺]-1-丙磺酸、20 mmol/L DTT（用前加）、2%固相pH梯度干膠條緩沖液、少量溴酚藍}共350μL，上樣1.2 mg。聚焦槽放于等電聚焦儀上，設置聚焦參數(shù)（30 V，12 h；200 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；5 000 V，1 h；8 000 V，10 h），總Vhrs為80 000[13]。等電聚焦電泳后，固相pH梯度干膠條取出，分別在SDS平衡液[6 mol/L尿素、2% SDS、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、30%甘油、少量溴酚藍，a∶10 mL平衡緩沖液加100 mg DTT；b∶10 mL平衡緩沖液加250 mg碘乙酰胺]中平衡1次，約15 min。后轉入SDS-PAGE膠上，進行第二向電泳，參數(shù)設置（恒流20 mA，40 min；30 mA，4 h），溴酚藍前沿至陽極約5 mm時停止電泳[14]。

1.6 凝膠染色 采用硝酸銀染色方法，固定2 h（冰醋酸30 mL、甲醇150 mL、甲醛0.15 mL，并加入超純水使容積達300 mL），硫代硫酸鈉敏化2 min，超純水漂洗3×5 min，銀染25 min，漂洗3×1 min，Na2CO3顯色0～8 min，甲醇冰醋酸混合液終止10 min。

1.7 圖像分析 每組樣品常規(guī)進行3次二維電泳，染色的凝膠利用Image Scanner光學掃描儀掃描并備份凝膠圖像，用ImageMaster 2D Labscan V3.1軟件（GE，Ann Arbor，Michigan，USA）進行圖像分析，采用假手術組作為參考標準，其他組凝膠與之匹配，以蛋白表達水平上調或下調150%為目標點，尋找差異蛋白質點并進行質譜鑒定。

1.8 蛋白質鑒定 采用斑點切膠儀切取制備膠上匹配的差異蛋白點。r酶切儀對切取的膠塊進行胰蛋白酶酶切，37 ℃下作用2 h，用50%乙腈-0.1%三氟乙酸溶液60μL溶解并提取肽段。Ettan spotter吸取0.3μL多肽樣品與等體積a-氰基-4-羥基肉桂酸混勻后點樣。應用MALDI-TOF-MS計算肽質量指紋圖譜。將所得到的肽質量指紋譜輸入美國國立生物技術信息中心（NCBI）蛋白質數(shù)據(jù)庫（http∶//www. ncbi.nlm.nih.gov/protein）進行檢索，鑒定的基本條件是覆蓋率＞20%，期望值＜0.05。所得的肽段質量數(shù)在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（http∶//us.expasy. org/sprot）中檢索，進行驗證。

2 結果

2.1 蛋白質定量 Bradford法測得蛋白線性方程為y=0.0098x+0.2666，相關系數(shù)R2=0.7857，在595 nm處測定各組樣品的吸光度，求出蛋白質濃度：假手術組15.6μg/μL，模型組14.3μg/μL，G-CSF治療組16.1μg/μL。

2.2 雙向凝膠電泳圖譜 取等量假手術組、模型組及G-CSF治療組大鼠缺血側（右側）大腦皮質蛋白質分別行雙向電泳分離，經過圖像分析，可以分辨出1 000個左右的蛋白質點（見圖1）。

圖1 大鼠大腦皮質蛋白質雙向電泳凝膠圖譜（硝酸銀染色）

G-CSF治療組與模型組比較有35個差異蛋白點，表達下調16個，表達上調19個；模型組和假手術組比較有56個差異蛋白質點，表達下調39個，表達上調17個（見圖2）。具有代表性的差異蛋白質點局部見圖3。

圖2 不同組差異蛋白的分布

2.3 質譜鑒定 將所得到的肽質量指紋譜，輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行檢索，并在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中驗證，模型組與假手術組比較差異蛋白質點19個，表達上調12個，表達下調7個。表達上調的蛋白質為14-3-3蛋白、蘋果酸脫氫酶、抑制素、異檸檬酸脫氫酶、熱休克蛋白5前體、烯醇（化）酶、腦型肌酸激酶同功酶、泛醌-細胞色素C還原酶、膠質纖維酸性蛋白、ATP合酶、琥珀酸脫氫酶復合體亞單位A、熱休克蛋白72。表達下調的蛋白質包括：Rho GDP解離抑制因子、肌動蛋白、Rab GDP解離抑制因子、內皮黏蛋白前體、內皮黏蛋白、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白、二氫嘧啶酶相關蛋白2。G-CSF治療組與模型組比較鑒定保護差異蛋白質6個，均表達上調（見圖4）。差異蛋白質為Rho GDP解離抑制因子、二氫嘧啶酶相關蛋白2、Rab GDP解離抑制因子、內皮黏蛋白、膠質纖維酸性蛋白、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白。

圖3 各組間二氫嘧啶酶相關蛋白2（503號蛋白點）的差異表達

圖4 肽質量指紋譜圖（鑒定成功的6種G-CSF治療組與模型組差異蛋白質）

3 討論

G-CSF是骨髓造血細胞生長因子，存在于神經元和膠質細胞上，后者有粒細胞集落刺激因子受體（GCSFR）表達，外源性G-CSF可以通過血腦屏障，與神經細胞膜上的G-CSFR結合，在中樞神經系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，與許多神經系統(tǒng)疾病有密切關系[15]。腦缺血時，G-CSF能提高外周血干細胞數(shù)量，促進缺血環(huán)境中干細胞向神經細胞分化，修復受損缺血低氧神經細胞，并有抗炎癥及抗凋亡作用，促進神經功能的恢復[16]。隨著蛋白質組學技術不斷發(fā)展成熟，蛋白質水平的實驗研究在揭示神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制、診療用藥方面體現(xiàn)出巨大潛力。由于G-CSF生物活性在體內外有很大區(qū)別，穩(wěn)定性差，因此，本實驗利用基因重組技術生產的rhG-CSF為實驗用藥，將蛋白質組技術應用于G-CSF腦保護機制研究中，為G-CSF應用于缺血性腦血管病提供蛋白質組學資料。

本實驗建立正常SD大鼠腦組織蛋白質組蛋白質雙向凝膠電泳圖像，通過圖像分析技術和計算機軟件對蛋白質圖像進行分析，模型組與假手術組比較表達上調的蛋白質為14-3-3蛋白、蘋果酸脫氫酶、抑制素、異檸檬酸脫氫酶、熱休克蛋白5前體、烯醇（化）酶、腦型肌酸激酶同功酶、泛醌-細胞色素C還原酶、膠質纖維酸性蛋白、ATP合酶、琥珀酸脫氫酶復合體亞單位A、熱休克蛋白72。模型組大鼠中間代謝酶類蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶復合體亞蛋白A、ATP合酶β亞基、烯醇化酶均表達上調，提示腦缺血能量代謝發(fā)生障礙，腦組織中ATP合酶活性的改變是神經元細胞質膜損害的標志，也是神經元繼發(fā)損傷的重要環(huán)節(jié)[17]。腦肌酸激酶是在腦內催化ATP和肌酸轉化為ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶，腦缺血再灌注損傷后腦肌酸激酶釋放增加可能是自體保護增加能量釋放的體現(xiàn)。腦缺血再灌注損傷后可出現(xiàn)細胞凋亡，泛醌-細胞色素C還原酶是電化學潛能的呼吸鏈的組成成分。14-3-3蛋白參與神經細胞生長、分裂、分化、凋亡等生理病理過程[18]，14-3-3蛋白及熱休克蛋白72在腦缺血后表達上調，可能是腦缺血再灌損傷后神經細胞凋亡及再生的表現(xiàn)，提示缺血后氧化應激反應增強，腦缺血保護機制啟動。二氫嘧啶酶相關蛋白可以通過調節(jié)微管的生成促進軸突生長和髓鞘穩(wěn)定[19]，內皮黏蛋白在腫瘤的血管發(fā)生中發(fā)揮作用[20]，二者在模型組表達下調，G-CSF治療組表達上調，提示G-CSF治療后可能新生血管增多，軸突生長，從而起到促進神經功能恢復的作用。鳥嘌呤核苷酸結合蛋白、Rab GDP解離抑制因子、Rho GDP解離抑制因子在腦缺血發(fā)生后均表達變少，而在GCSF治療組均有增多，但是由于它們具有多種生物學效應，推測這三種蛋白質可能在G-CSF治療后能促進信號轉導。

綜上所述，本實驗將蛋白組技術應用于腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)經G-CSF治療后缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層相關蛋白質改變，提示G-CSF對缺血性腦血管治療作用與其能調節(jié)多種神經再生相關蛋白質的表達有關，但具體調節(jié)機制尚需進一步研究。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of recombined granulocyte colony-stimulating factor on cerebral cortical proteins of ischemia-reperfusion injury rats

LIU Baohua1, SHA Ying2, BAI Guanghui3, LI Yong4, WU Wei4, SHANG Ping1, WANG Xiaotong1.
1.Department of Rehabilitation, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gerontology, the First Hospital of Jilin University, Changchun, 130021; 3.Department of Radiology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 4.Department of Neurology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To research the relation between difference protein with neuron protective effect of G-CSF in ischemia-reperfusion rats brain by using proteomics.Methods: Twenty-four experimental Wistar rats were divide into 3 groups, control group, rats cured by G-CSF group (G-CSF group), ischemia-reperfusion injured rats group (I/R group). Ischemia-reperfusion injury rats model was generated by using Koizumi's way in G group and I/R group, one nylon thread was used to block the rats middle cerebral artery and reperfused after 2 hours. G-CSF (50 μg/kg/d) was injected subcutaneously on rats' backs for successive 5 days in G-CSF group. Rats were executed and decapitated after 14 days after reperfusion to get the brain respectively. Sodium chloride injection was used in I/R group and control group. Cortex proteins were extracted in the 3 groups of rats. Then the maps of the proteins were established by DIGE (differential gel electrophoresis, DIGE). The altered protein spots were identifed with MALDI-TOF-MS and database searching.Results: Compared with the contrl group, the I/R group gained 56 differential protein spots, 39 spots expressed lowly, and 17 spots high. Compared with I/R group, the G-SCF group gained 35 differential protein spots, 16 spots expressed lowly, and 19 spots high, identifed 6 protein spots, including dihydropyrimidinase-associated protein 2, glial fbrillary acidic protein, endomucin, Rho GDP dissociation inhibitor, Rab GDP dissociation inhibitor and guanine-nucleotide-binding protein.Conclusion: G-CSF is involved in neuroprotection after brain ischemia, possibly by regulating the expression of various neural regeneration-associated proteins at the subacute stage.

granulocyte-colony stimulating factor; brain ischemia; proteome; neural regeneration; rats

R743

： A

： 1000-2138（2014）05-0329-06

2014-03-31

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃項目（2013RCA036）。

劉寶華（1976-），男，陜西丹鳳人，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士。

王小同，主任醫(yī)師，教授，Email：wangxt22@163.com。