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    微生物中氧化態(tài)硒還原酶的研究進(jìn)展

    2014-03-07 11:24:00王東亮毛貝蓓
    藥學(xué)研究 2014年1期
    關(guān)鍵詞:還原酶酸鹽基轉(zhuǎn)移酶

    王東亮,毛貝蓓,張 路,肖 敏

    (1.山東東阿阿膠股份有限公司,山東聊城252201;2.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心,山東聊城252201;3.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟(jì)南250012)

    ·綜 述·

    微生物中氧化態(tài)硒還原酶的研究進(jìn)展

    王東亮1,2,毛貝蓓1,張 路1,2,肖 敏3

    (1.山東東阿阿膠股份有限公司,山東聊城252201;2.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心,山東聊城252201;3.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟(jì)南250012)

    微生物還原氧化態(tài)硒對(duì)于硒在自然界的循環(huán)有重要作用,目前發(fā)現(xiàn)的還原方式主要有三種,即硒酸鹽/亞硒酸鹽經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶或谷胱甘肽(GSH)作用后成為可揮發(fā)性的甲基硒化物;在細(xì)胞內(nèi)的與含巰基的化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),生成硒中間產(chǎn)物,進(jìn)入各種代謝途徑,或被巰基還原酶還原為Se0;反硝化細(xì)菌內(nèi)硝酸還原酶具有還原氧化態(tài)硒的功能,發(fā)現(xiàn)另一種氧化態(tài)硒還原酶可以專門地還原氧化態(tài)硒為低價(jià)態(tài)或單質(zhì),該酶被發(fā)現(xiàn)同屬于Ⅱ型鉬酶家族。本文綜述了氧化態(tài)硒還原酶的研究進(jìn)展,以及在生化、遺傳、基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法研究中的應(yīng)用。

    氧化態(tài)硒還原酶;鉬酶;硒酸鹽;亞硒酸鹽

    硒是生物體必需的微量元素,其在生物體中主要以硒半胱氨酸、硒蛋氨酸等有機(jī)形式存在,作為機(jī)體中許多重要的酶—如谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶、過氧化物酶、SOD以及甲狀腺素脫碘酶等—的反應(yīng)中心而參與各種反應(yīng)[1]。在低濃度時(shí)具有抗誘變、抗致癌作用。高濃度時(shí)又能致突變及可能的致癌作用。硒的毒性大小與其化學(xué)狀態(tài)和濃度有關(guān),硒的安全濃度范圍非常狹窄,成人建議攝入量55μg·d-1,最高安全攝入量400μg·d-1[2]。輕度缺硒會(huì)降低免疫力,導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥、脫發(fā)脫甲等,重度可能影響心肌和骨骼功能等,甚至導(dǎo)致基因的變異和斷裂[3]。

    硒的分布具有明顯的地區(qū)差異性,除湖北恩施等個(gè)別地方外,世界上人口密集的地區(qū)硒含量往往很低。人體缺硒成為一種普遍現(xiàn)象。然而環(huán)境中硒元素主要以氧化態(tài)硒(SeO32-和SeO42-)的形式存在,這兩種可溶性的無機(jī)物具有很高的毒性。因此,把高毒性硒轉(zhuǎn)化成低毒、可有效利用的硒成為研究的熱點(diǎn)。

    另一方面,隨著人類的發(fā)展,活動(dòng)范圍擴(kuò)大,硒污染的程度也在加重。冶金工業(yè)、原油精煉排出的廢水中含有大量的SeO32-,它是硒的主要污染源之一。此外,燃煤[4]是硒的最主要污染源,中國(guó)煤礦中硒平均含量(5.6 mg·kg-1)高于世界煤中硒平均含量(3.0 mg·kg-1)。燃煤產(chǎn)生的SeO2易溶于水形成SeO32-和SeO42-。硒污染的治理在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得

    到廣泛的重視。

    目前,國(guó)內(nèi)有關(guān)硒的研究主要集中在微生物富集氧化態(tài)硒的能力大小、硒化合物合成、食品中硒添加劑以及化學(xué)方法還原氧化態(tài)硒等表面研究上,在氧化態(tài)硒的轉(zhuǎn)化機(jī)制上研究不深入。而在國(guó)際上,微生物轉(zhuǎn)化硒的機(jī)制研究日益增多,對(duì)微生物初步還原氧化態(tài)硒形成了多種推測(cè)及觀點(diǎn)。鑒于硒還原研究的工作對(duì)今后了解復(fù)雜的非金屬氧化物代謝的研究意義以及環(huán)境治理、安全有效補(bǔ)硒的應(yīng)用意義,本文就氧化態(tài)硒初步轉(zhuǎn)化機(jī)制以及其中涉及的重要酶的關(guān)鍵問題進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和綜述。

    1 硒還原研究

    越來越多的微生物被發(fā)現(xiàn)可以耐受高濃度的氧化態(tài)硒(亞硒酸鹽和硒酸鹽),并轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒和紅色硒顆粒。1981年,Sarathchandra等[5]利用Bacillus megaterium進(jìn)行硒的生物轉(zhuǎn)化時(shí),發(fā)現(xiàn)紅色硒單質(zhì)的生成現(xiàn)象。此后更多的菌株被發(fā)現(xiàn)具有生成紅色單質(zhì)硒的能力[6~9]。亞硒酸鹽或硒酸鹽在不同微生物中的可利用性不同,有的微生物兩者都可以利用,如Escherichia coli[10]、Thauera.Selenatis[11]和Enterobacter cloacae SLD1a-1[12]。但有的微生物偏好利用亞硒酸鹽,如Rhodobacter spheroids[13],Ralstonia metallidurans[14]。不同微生物耐受氧化態(tài)硒的能力不同,Rhizobium sp.[8]和Azospira oryzae[15],其最低抑制生長(zhǎng)濃度(MIC)分別為16 mmol·L-1和50mmol·L-1,最高轉(zhuǎn)化量分別為8mmol·L-1和4mmol·L-1;Tetrathiobacter kashmirensis[16]的MIC為64 mmol·L-1,是目前報(bào)道的耐受硒的能力最高的菌株。微生物高的硒耐受能力對(duì)于硒污染的環(huán)境治理有重要意義。此外,在真菌、藻類以及植物中也有發(fā)現(xiàn)氧化態(tài)硒耐受性,正在進(jìn)行各種應(yīng)用研究。

    2 氧化態(tài)硒初步還原的途徑

    目前推定的細(xì)胞內(nèi)氧化態(tài)硒初步還原的途徑,主要有以下三種。

    2.1 亞硒酸鹽甲基化 亞硒酸鹽甲基化后轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性氣體,主要有二甲基硒(DMSe)和二甲基二硒(DMDSe)等,參與反應(yīng)的酶是甲基轉(zhuǎn)移酶。Ranjard等[17]在Escherichia coli中證實(shí)硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶參與了氧化態(tài)硒和有機(jī)硒(如(Met-)Se-Cys)的甲基化過程,產(chǎn)物有DMSe和DMDSe,這個(gè)過程涉及幾個(gè)還原和甲基化步驟。這是首次發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶具有硒甲基化功能。Ranjard等[18]在淡水細(xì)菌中又發(fā)現(xiàn)了一組硒甲基轉(zhuǎn)移酶系,命名為Mm tA,系統(tǒng)發(fā)育分析把類似MmtA的序列分為兩個(gè)簇,一個(gè)組是S-和O-甲基轉(zhuǎn)移酶;另一組是UbiE C-甲基轉(zhuǎn)移酶,該酶參與泛醌和甲基萘醌的合成,這組酶系與硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶作用過程不同,它不需要還原步驟,可以直接把氧化態(tài)硒和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性硒化物。Swearingen等[19]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了UbiE C-甲基轉(zhuǎn)移酶的硒甲基化功能,他們把Geobacillus stearother-mophilus來源的ubie基因轉(zhuǎn)入ubie缺陷型Escherichia coli中,發(fā)現(xiàn)該基因編碼的產(chǎn)物除了具有典型的C-甲基化活性以外,還有硒生物甲基化的功能。

    此外,研究發(fā)現(xiàn)GSH可能也參與了揮發(fā)性硒化物的生成。Kessi[20]研究加硒培養(yǎng)的紫色非硫細(xì)菌發(fā)現(xiàn)有揮發(fā)性硒化物產(chǎn)生,但當(dāng)加入GSH的合成酶抑制劑(BSO)后,檢測(cè)不到揮發(fā)性硒化物,揮發(fā)性硫化物的代謝也受到影響,推測(cè)谷胱甘肽可能與氣態(tài)硒化物的合成有關(guān)系,而且揮發(fā)性硒、硫化合物的代謝可能有同樣的酶參與,但還沒有在理論上證實(shí)。隨著研究的深入,將有更多的具有硒甲基化功能的酶或其他化合物被發(fā)現(xiàn),而且其多樣化的甲基化代謝途徑也將逐漸被闡明。

    2.2 細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)還原途徑 參與這類反應(yīng)的主要是含巰基的化合物或蛋白,如谷胱甘肽/谷胱甘肽還原酶,硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶等,它們是原核和真核細(xì)胞中最主要的硫醇之一,可以迅速與亞硒酸鹽反應(yīng)。Ganther[21]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物組織中谷胱甘肽參與了亞硒酸鹽的還原。二者的反應(yīng)方程:

    中間體GS-Se-SG可以進(jìn)入各種代謝途徑,被生物體同化[10],同時(shí)它也是含巰基蛋白及其還原酶的高效氧化劑,可以被還原酶進(jìn)一步還原為Se0,伴隨產(chǎn)物有H O和O′-。

    222后來,該反應(yīng)在Escherichia coli[22]轉(zhuǎn)化硒的實(shí)驗(yàn)中利用同位素77Se和核磁分析證實(shí)該過程的存在。而且,Gabel-Jensen C[23]研究了豬小腸的上皮細(xì)胞代謝亞硒酸鹽過程,發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-Cys、L-GSH和亞硒酸鹽一起存在時(shí),代謝物迅速形成并在15 min后消失,副產(chǎn)物揮發(fā)或沉淀,該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象支持了“2.1”中GSH參與甲基化的觀點(diǎn)。利用LC-ESI-MS技術(shù)檢測(cè)到的含硒中間物只有Cys-Se-Cys、Cys-Se-SG和GS-Se-SG。此外,在Rb.sphaeroides和E.coli[24,25]中發(fā)現(xiàn)加硒培養(yǎng)可以誘導(dǎo)谷胱甘肽還原酶的合成。同時(shí),Bébien等[25]發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽系統(tǒng),在與亞硒酸鹽反應(yīng)時(shí),具有相同的性質(zhì)。并且在E.coli中硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶更容易被誘導(dǎo)合成。細(xì)胞中還原態(tài)巰基化合物可以減弱氧化態(tài)硒毒性帶來的脂質(zhì)類氧化性損傷,因此,其含量是細(xì)胞的硒耐受能力的重要影響之一,這也說明了細(xì)胞內(nèi)化學(xué)還原和酶催化還原反應(yīng)不是孤立的,而是相互聯(lián)系、相互影響的。

    2.3 細(xì)胞內(nèi)的酶參與的氧化態(tài)硒還原反應(yīng) 除了化學(xué)還原方式以外,酶促反應(yīng)也逐漸被揭示。一種方式是氧化態(tài)硒的還原與反硝化作用有關(guān),另一種方式是特有的氧化態(tài)硒還原酶參與了催化反應(yīng)。這兩種還原方式中參與的主要酶都是Ⅱ型鉬酶類。下面將詳細(xì)闡述。

    3 氧化態(tài)硒還原酶的分類

    3.1 硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶催化氧化態(tài)硒的還原 反硝化菌是其中的代表,它有兩種酶類,即周質(zhì)空間酶和膜結(jié)合蛋白酶,Rb.sphaeroides[13]位于周質(zhì)空間的硝酸鹽還原酶(NAR)及E.coli[26]膜結(jié)合狀態(tài)的硝酸鹽還原酶,在以芐基紫精為電子供體時(shí)可以在體外還原硒酸鹽。后來研究發(fā)現(xiàn)這是反硝化細(xì)菌的普遍特征。Ralstonia eutropha,Paracoccus denitrificans,Paracoccus pantotrophus內(nèi)的硝酸鹽還原酶都可

    以以硒酸鹽為電子受體[27]。硝酸鹽還原酶含有鉬輔因子活性中心,是Ⅱ型鉬酶的一種[28]。

    3.2 氧化態(tài)硒還原的鉬依賴性還原酶 目前發(fā)現(xiàn)的這類酶有一個(gè)共同的特點(diǎn),即酶活性中心都有含鉬輔因子。按底物不同分為硒酸鹽還原酶和亞硒酸鹽還原酶。硒酸鹽還原酶專門催化硒酸鹽為亞硒酸鹽。在厭氧微生物中,以氧化態(tài)硒為最終的電子受體,細(xì)胞通過厭氧呼吸得到能量。從受硒污染嚴(yán)重的圣華金河谷地篩選出的Thauera.selenatis[11]中,首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周質(zhì)空間有一個(gè)特異的硒酸鹽還原酶,而其硝酸鹽還原酶則位于細(xì)胞質(zhì)膜上,這說明硒酸鹽和硝酸鹽還原可能是由兩個(gè)獨(dú)立的酶催化完成的。硒酸鹽還原酶只能以硒酸鹽為底物反應(yīng)生成亞硒酸鹽,不能以亞硝酸鹽、硝酸鹽、氯酸鹽和硫酸鹽為底物。而亞硒酸鹽的還原則是通過亞硝酸鹽還原酶催化轉(zhuǎn)化為硒顆粒。研究同時(shí)也顯示該酶不是其他氧化物還原途徑的一部分。硒酸鹽的還原過程與細(xì)胞生長(zhǎng)偶連,硒酸鹽還原酶(SER)可能是電子傳遞的一部分,通過質(zhì)膜產(chǎn)生電化學(xué)勢(shì)能。純化后得到該酶的組成信息,分子量為180 kDa,由SerA、SerB和SerC 3個(gè)異源亞基組成(96 kDa,40 kDa,23 kDa)。首次對(duì)硒酸鹽還原酶的三個(gè)亞基進(jìn)行了N端測(cè)序。SerA亞基N末端富含Cys結(jié)構(gòu)域,可能含有一個(gè)[4Fe-4S]簇,同時(shí)含有一個(gè)以鉬元素為活性位點(diǎn)的鉬蝶呤輔因子。SerB也含有富含Cys結(jié)構(gòu)域,可能也含有[Fe-S]簇。光譜分析發(fā)現(xiàn)SerC含有一個(gè)細(xì)胞色素b。對(duì)T.selenatis[29]的硒酸鹽還原酶基因進(jìn)行DNA序列分析還發(fā)現(xiàn)了第四個(gè)組成元件SerD,它可能的作用是作為特異的分子伴侶使鉬蝶呤輔因子正確插入SerA。ERP譜和序列比對(duì)表明SER是Ⅱ型鉬酶的一個(gè)成員[28],SER是目前了解比較清楚的酶之一。

    另一個(gè)了解比較清楚的SER是在Enterobacter cloacae SLD1a-1質(zhì)膜上[30]。該菌也是在圣華金河谷地發(fā)現(xiàn)的,首次純化出了膜結(jié)合的硒酸還原酶。細(xì)胞質(zhì)膜上定位著兩個(gè)不同的酶:硒酸鹽還原酶(SER)和硝酸鹽還原酶(NAP),前者只能以硒酸鹽和氯酸鹽為底物。而后者只能以硝酸鹽和氯酸鹽為底物。E.cloacae的SER與T.selenatis中的SER組成有相似之處。其表觀分子量為~600 kDa,是一個(gè)異源三聚體復(fù)合物,大小分別為~100 kDa(α)、~55 kDa(β)、~36 kDa(γ)。預(yù)想的整體組成為α3β3γ3,該酶也含有鉬、亞鐵血紅素、非亞鐵血紅素鐵離子作為輔基因子,電子吸收光譜顯示在活性中心有一個(gè)細(xì)胞色素b。經(jīng)SDS-PAGE后分離的亞基不能成功進(jìn)行N-末端序列分析,阻礙了對(duì)其結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。因此該酶的基因序列還不清楚。不同的還原酶的好處在于,硒酸鹽不會(huì)與硝酸鹽競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn),從而有利于細(xì)胞在高濃度硒酸鹽的環(huán)境中存活。

    另一種酶是亞硒酸鈉還原酶,催化亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒顆粒Se0,該酶主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。已在球形紅細(xì)菌和根瘤菌中發(fā)現(xiàn)。球形紅細(xì)菌中亞硒酸鹽還原酶可能是一個(gè)由亞硒酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白,兩個(gè)影響鉬輔因子合成的突變株中亞硒酸鹽的還原速率降低了,而且細(xì)胞培養(yǎng)基中加入鉬酶的抑制劑鎢酸鹽后,亞硒酸鹽的還原速率降低了同樣程度,減少了原速率的40%[31]。這說明亞硒酸鹽還原酶中可能含有鉬元素,且承擔(dān)了細(xì)胞還原亞硒酸鹽能力的40%。同時(shí)說明該微生物細(xì)胞中亞硒酸鹽還原還有其他未知的途徑(約占60%)。研究發(fā)現(xiàn)該亞硒酸鹽還原酶與其他Ⅱ型鉬酶(如硝酸鹽、生物素亞砜和二甲基亞砜的還原酶)不同。但酶的組成及性質(zhì)還不清楚。

    Rhizobium sp.可以在有氧條件下轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉為硒顆粒,鎢酸鹽可以抑制細(xì)胞內(nèi)亞硒酸鹽的還原,說明還原途徑中涉及到鉬酶的催化作用[8]。非變形梯度電泳得到兩條有亞硒酸鹽還原活性蛋白條帶,分別為~100 kDa和~40 kDa。盡管還原機(jī)制還不清楚,這是第一次報(bào)道一株菌中有兩種還原亞硒酸鹽的蛋白。在Azospira oryzae中發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有還原硒酸鹽和亞硒酸鹽的酶,大小分別為~500 kDa和~55 kDa[9]。還原硒酸鹽的酶和有還原硫酸鹽活性的酶不同。亞硒酸鹽還原也和硒酸鹽、硫酸鹽、亞硝酸鹽及二甲基亞砜明顯不同。同時(shí)含有兩種硒還原酶微生物,對(duì)受硒污染的水域治理將有很大幫助。因此兩個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)還值得深入研究。

    4 酶的初步研究方法

    4.1 生化分析 有氧或厭氧條件下建立氧化態(tài)硒還原曲線,通過添加可能對(duì)硒還原有影響的化合物,檢測(cè)加入的化合物對(duì)氧化態(tài)硒還原影響。例如在細(xì)胞培養(yǎng)基里添加硝酸鹽或亞硝酸鹽,鉬酶的底物,鉬酶的抑制劑[8,13,31]等。進(jìn)而推測(cè)可能的還原途徑及相互關(guān)系。

    4.2 構(gòu)建基因文庫(kù)或轉(zhuǎn)座子文庫(kù)來獲得相關(guān)影響基因 將E.cloacae的基因文庫(kù)[32]轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)無還原硒能力的E.coli SK17-1中,突變子涂于含抗生素和亞硒酸鈉的平板上,篩選紅色菌落,分析基因序列,最終獲得使SK17-1還原亞硒酸鹽的基因序列。也可以從轉(zhuǎn)座子文庫(kù)里篩選出影響氧化態(tài)硒還原的突變子。利用Tn5[31]或Tn10[33]轉(zhuǎn)座子構(gòu)建文庫(kù),通過反向PCR定位Tn5轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn),然后測(cè)定基因序列。選擇Tn5單插入的突變子序列分析,發(fā)現(xiàn)了一些與氧化態(tài)硒還原有關(guān)的調(diào)控基因或者對(duì)含鉬輔因子合成有關(guān)系的基因片段。雖然試驗(yàn)繁瑣,但是可以較快得到與硒還原相關(guān)的基因信息。

    4.3 蛋白質(zhì)組學(xué)方法 主要通過添加氧化態(tài)硒培養(yǎng)后,比較細(xì)胞中蛋白的二維圖譜變化,選擇有明顯變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定功能分類。在Stenotrophomonas maltophilia SeITE02[34]培養(yǎng)基中添加亞硒酸鹽和亞硝酸鹽離子后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性蛋白做二維電泳,獲得蛋白圖譜,與正常培養(yǎng)獲得的二維圖譜比較,挑出圖譜中異常表達(dá)的蛋白。經(jīng)質(zhì)譜分析把有明顯變化的蛋白點(diǎn)歸為以下幾類:受損蛋白降解類、DNA代謝類、細(xì)胞分裂類和氧化應(yīng)激反應(yīng)類。被誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白有:過氧化氫酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶前體和GSH合成酶。H2O2是亞硒酸鹽被GSH非生物還原的副產(chǎn)物,支持了GSH參與細(xì)胞內(nèi)第一步還原反應(yīng)的假設(shè)。谷氨酸-半胱氨酸連接酶作用是驅(qū)動(dòng)真菌、藍(lán)細(xì)菌、紫細(xì)菌等

    的GSH生物合成通路,這些都是為了抵御外界高濃度亞硒酸鹽環(huán)境所作出的反應(yīng),從而可以推測(cè)細(xì)胞代謝硒的各種通路。

    4.5 酶活測(cè)定方法 基于甲基紫精微孔板法測(cè)定氧化態(tài)硒還原酶酶活[35]。這種方法適用于酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量低、酶活也相對(duì)較低的情況。它要求的酶樣品量低(<5μL),可以同時(shí)測(cè)定不同底物的專一性試驗(yàn)。在酶活動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定、最佳pH、抑制劑等方面靈活準(zhǔn)確性好。與其他氧化酶相比,膜蛋白酶及周質(zhì)空間酶的酶活測(cè)定特別適用。

    5 氧化態(tài)硒還原酶的調(diào)控基因

    氧化態(tài)硒在自然界中循環(huán)受環(huán)境微生物代謝影響生成有機(jī)硒或還原為硒顆粒。但氧化態(tài)硒還原涉及的基因調(diào)控機(jī)制還不清楚。目前只在Enterobacter cloacae SLD1a-1[32]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)調(diào)控基因——延胡索酸還原反應(yīng)調(diào)控基因fnr,該基因可以控制硒酸鹽還原酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)在無還原氧化態(tài)硒現(xiàn)象的E.coli S17-1中異源表達(dá)fnr后,Escherichia coli S17-1具有了和Enterobacter cloacae SLD1a-1同樣的還原氧化態(tài)硒的能力,通過構(gòu)建基因文庫(kù)對(duì)陽性突變子進(jìn)行定向克隆找到可能相關(guān)的基因fnr。在Enterobacter cloacae SLD1a-1中fnr缺失突變,發(fā)現(xiàn)突變子失去產(chǎn)生紅色硒單質(zhì)的能力。兩者共同證實(shí)了fnr調(diào)控硒酸鹽還原酶的功能。其具體的調(diào)控機(jī)制不清楚。全基因組轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示FNR蛋白調(diào)控至少103個(gè)操縱子。在E.coli[36]中,F(xiàn)NR蛋白調(diào)控著厭氧呼吸酶的表達(dá),包括硝酸鹽還原酶、延胡索酸還原酶及二甲基亞砜還原酶。FNR蛋白位于細(xì)胞質(zhì),含有一個(gè)[4Fe-4S]2+簇連接4個(gè)重要的半胱氨酸殘基,是專一結(jié)合DNA的活性位點(diǎn)。FNR對(duì)O2敏感,有氧氣存在時(shí),[4Fe-4S]2+簇被迅速氧化為[2Fe-2S]2+,不能結(jié)合DNA。因此FNR在厭氧條件下才有調(diào)節(jié)活性,控制硒酸鹽還原酶的表達(dá)量。氧化態(tài)硒還原酶的遺傳鑒定和表達(dá)動(dòng)力學(xué)測(cè)定,有助于深入地闡明微生物中硒代謝機(jī)制,揭開地球化學(xué)對(duì)微生物的影響。

    6 展望

    氧化態(tài)硒的多種多樣的還原方式有利于微生物靈活地抵制外界環(huán)境的氧化壓力。但還原酶的研究進(jìn)度較慢,可能與這類酶在細(xì)胞中的含量、組成復(fù)雜性以及體外提取的穩(wěn)定性和可行性等有關(guān)。目前僅有個(gè)別菌株的還原酶得到提純和遺傳組成信息,更多高耐受硒能力的微生物的還原酶仍需弄清楚,這將對(duì)高效還原氧化態(tài)硒有很大幫助。不同微生物中該還原酶性質(zhì)可能差別很大,有些酶的活力測(cè)定要在厭氧條件下長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng),反應(yīng)速度慢。氧化還原酶還易受其他底物影響。因此酶蛋白提取方法及靈敏的測(cè)定方法還需要摸索,這可能是它在很長(zhǎng)一段時(shí)間里進(jìn)展緩慢的原因之一。

    此外,氧化態(tài)硒還原過程中的調(diào)控機(jī)制以及酶的氧化還原中心及能量傳遞等細(xì)節(jié)尚不清楚,是亟待解決的問題。隨著人們對(duì)環(huán)境治理的重視,氧化態(tài)硒還原的機(jī)制研究日益被人們重視。利用生化分析、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳分析等方法,有助于微生物代謝硒的研究,對(duì)解決硒污染水體的環(huán)境治理及安全補(bǔ)硒有重要意義。

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    Research Progress on the selenium oxyanions reductase in microorganisms

    WANG Dong-liang1,2,MAO Bei-bei1,ZHANG Lu1,2,XIAO Min3
    (1.Shandong Dong-E E-Jiao Co.,Ltd.,Liaocheng 252201,China;2.National Engineering Technology Research Center of Glue of Traditional Medicine,Liaocheng 252201,China;3.College of Life Sciences,Shandong University,Jinan 250012,China)

    The reduction of selenium oxyanions by microorganisms plays an important role in the circulation of nature.By now,3 mainly reduction ways had been discovered:selenate/selenite turns into volatile dhimethyl selenide by methyltransferase or glutathione(GSH);It will react with mercapto compounds,and turn into selenium intermediate product,and then goes into different metabolic pathways,or reduce into Se0by thiol reductase;The nitrate reductase in denitrifying bacteria has the function of reducing selenium oxyanions.The selenium oxyanions can be reduced to low state or Se0by the other kind of the selenium oxyanions reductase,the enzyme belongs to molybdenum enzymesⅡ.This text summarized the progress in research of the selenium oxyanions reductase,and application in biochemistry,genetics,genomics and proteomics.

    Selenium oxyanions reductase;Molybdenum enzymes;Selenate;Selenite

    S154.3

    A

    2095-5375(2014)01-0034-006

    國(guó)家自然基金項(xiàng)目(糖工程技術(shù)與鉑類抗腫瘤藥物的靶向性改造,No.21172135)

    王東亮,男,博士研究生,研究方向:中藥藥理,E-mail:wangdl@dongeejiao.com

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