MTT法檢測非小細胞肺癌對紫杉醇的敏感性

李鵬翀，趙博新，梁倩瑩，陳如大，李國鋒

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山528000，2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510515）

·實驗研究·

MTT法檢測非小細胞肺癌對紫杉醇的敏感性

李鵬翀1，趙博新2，梁倩瑩2，陳如大1，李國鋒2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山528000，2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510515）

目的探討四氮唑藍比色分析法（MTT法）用于指導(dǎo)臨床個體化化療藥物選擇的實用性，為非小細胞肺癌臨床化療用藥提供參考。方法培養(yǎng)肺癌A549細胞，加入不同濃度的紫杉醇，作用24、48、72、96 h，用MTT法計算細胞生長抑制率，測定其對腫瘤細胞的體外敏感性。結(jié)果不同濃度的紫杉醇對A549細胞的生長均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性。結(jié)論MTT法檢測有助于指導(dǎo)臨床選擇化療藥物劑量，提高化療效果，減少毒副作用，為非小細胞肺癌臨床個體化化療方案的選擇提供客觀依據(jù)。

非小細胞肺癌；紫杉醇；四氮唑藍比色分析法；人腺肺癌A549細胞

肺癌是死亡率最高的癌癥，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。在總的肺癌病例中，非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）約占80%（包括肺鱗癌、肺腺癌）。在NSCLC的治療過程中，化療作為全身性治療手段具有手術(shù)和放療治療不能替代的重要地位。由于腫瘤患者對不同劑量化療藥物的敏感型差異較大，且化療藥物具有毒副作用，因此化療藥物治療腫瘤的敏感劑量的篩選對指導(dǎo)臨床用藥，提高療效、減輕毒副作用等具有重要意義。

目前抗腫瘤藥物體外篩選的方法很多，主要由MTT比色法［1，2］、同位素滲入法、流式細胞儀法、ATP生物熒光法［3］以及SRB法［4］等，其中MTT比色法是用于檢測活細胞數(shù)目的常用方法，具有簡單、快速、精確等優(yōu)點。我們通過不同濃度的抗癌藥物紫杉醇作用于體外培養(yǎng)的A549細胞，借助MTT法檢測其抑制率，并對實驗結(jié)果進行分析。

1 材料

1.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌腫瘤細胞A549購于南京凱基生物科技有限公司，經(jīng)復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為A549細胞中加入含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、含5%CO2及充分飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，隔天換培養(yǎng)液，直至細胞鋪滿瓶底，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化并傳代，選對

數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 試劑與藥物、儀器設(shè)備 RPMI－1640培養(yǎng)液、含0.25%EDTA的胰蛋白酶（南京凱基生物科技有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物有限公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司）；紫杉醇（Paclitaxel，PTX，純度99.5%，西安天豐科技有限公司），臨用前用培養(yǎng)液將紫杉醇母液稀釋到所需濃度；二甲基亞砜（DMSO，天津市化學(xué)試劑一廠）、無水乙醇均為分析純。

Elx－800酶標儀（Bio Tek，USA）；倒置熒光顯微鏡IX71以及照相機（Olympus公司）；微孔板快速振蕩器QB－9001（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；細胞培養(yǎng)用96孔板（美國Corning Incorporated公司）。

2 方法

2.1 PTX對人腺肺癌A549細胞的細胞毒作用將處于對數(shù)生長期的A549細胞稀釋成4×104個·mL－1，分10組接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加200μL細胞懸液。24 h后細胞貼壁后，隨機選8組分別加入終濃度為0.000 64、0.003 2、0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL－1的PTX溶液，其余兩組設(shè)置為對照組（只加1%無水乙醇）、調(diào)零組（只加培養(yǎng)液）。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加MTT溶液（5 mg·mL－1）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去掉舊的培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 150μL，室溫振蕩10 min后，于酶標儀上單波長490 nm處測其OD值。根據(jù)OD值求算PTX對腫瘤細胞抑制率，計算公式為抑制率（IR）＝（對照組OD值均數(shù)－實驗組OD值均數(shù)）／對照組OD值×100%。

2.2 細胞形態(tài)觀察 各組細胞加藥作用48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間均數(shù)采用方差分析，兩兩比較用LSD法，以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 PTX對人腺肺癌A549細胞的細胞毒作用PTX對A549細胞具有較大的殺傷作用，在作用時間相同條件下，其細胞抑制率隨藥物濃度增加而上升。當藥物濃度達到50μg·mL－1時，其抑制率最高（見圖1）。表1示：（1）相同作用時間不同PTX濃度：①作用24 h，除濃度0.000 64μg·mL－1組與其他7個濃度組和0.003 2μg·mL－1組與50μg·mL－1組比較有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（P＜0.05）外，其余各組兩兩比較均無顯著性差異；②作用48 h，濃度0.000 64 μg·mL－1組除了與0.003 2μg·mL－1組比較無統(tǒng)計學(xué)顯著差異外，與其他6個濃度組比較，P＜0.05；0.003 2μg·mL－1組與50μg·mL－1組、10μg·mL－1組、2μg·mL－1組、0.4μg·mL－1組比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05；還有50μg·mL－1組與0.016 μg·mL－1組比較存在顯著性差異，P＜0.05；③作用72 h，濃度0.000 64μg·mL－1組與50μg·mL－1組、10μg·mL－1組、2μg·mL－1組、0.4μg·mL－1組、0.08μg·mL－1組和濃度0.003 2μg·mL－1組與50 μg·mL－1組、10μg·mL－1組、2μg·mL－1組、0.4 μg·mL－1組比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05；④作用96 h，濃度50μg·mL－1組與0.4μg·mL－1組、0.08μg·mL－1組、0.016μg·mL－1組、0.003 2 μg·mL－1組、0.000 64μg·mL－1組和濃度0.000 64 μg·mL－1組與10μg·mL－1組、2μg·mL－1組比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05。（2）相同濃度不同作用時間各組兩兩比較：①濃度50μg·mL－1：除48 h和72 h比較無統(tǒng)計學(xué)顯著差異外，其余各組兩兩比較，P＜0.05；②濃度10μg·mL－1：除48 h與72 h、96 h和72 h與96 h比較無統(tǒng)計學(xué)顯著差異外，其余各組兩兩比較，P＜0.05；③濃度2μg·mL－1：24 h與72 h、96 h比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05；④濃度0.4μg·mL－1：24 h與其他三個時間點比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05；⑤濃度0.08μg·mL－1與濃度0.016μg·mL－1：各個作用時間點兩兩比較，均無顯著性差異；⑥濃度0.003 2μg·mL－1：24 h與96 h比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05；⑦濃度0.000 64μg·mL－1：96 h與24 h、48 h比較存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P＜0.05。

表1 不同濃度PTX、不同作用時間對A549細胞平均抑制率（n＝3，±s，%）

表1 不同濃度PTX、不同作用時間對A549細胞平均抑制率（n＝3，±s，%）

濃度（μg·mL－1） 24 h 48 h 72 h 96 h F P .84 22.722 0.000 10 32.38±8.69 54.53±4.06 59.15±10.60 60.22±4.54 12.071 0.001 2 31.30±7.23 51.21±4.73 54.76±26.85 57.82±4.79 2.794 0.086 0.4 29.43±10.51 50.18±2.91 51.09±7.22 51.97±17.88 3.838 0.038 0.08 29.20±17.53 42.97±23.36 45.04±7.97 49. 50 37.01±8.15 57.18±1.14 59.60±4.33 76.40±9 92±17.73 1.101 0.390

續(xù)表1：

圖1 不同PTX濃度的平均抑制率

3.2 形態(tài)學(xué)改變 當PTX濃度為50μg·mL－1時，A549細胞處理48 h后形態(tài)存在明顯差異，詳見圖2。由圖2可見，PTX組（高濃度組）部分細胞體積變小，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象尤其明顯，同時有些細胞破裂，從中心散發(fā)出絲狀物。PTX（中低濃度組）細胞可見空泡化現(xiàn)象。而對照組細胞大多相對均一，貼壁生長，輪廓清晰。

圖2 A549細胞處理48 h后的形態(tài)變化（40×）A.PTX組（50μg·mL－1）；B.對照組

3.3 種細胞密度不同，OD值變化情況 種板密度不同，OD值變化趨勢見圖3。一般藥物作用24～72 h種板密度為4×104個·mL－1較好；作用72 h以上時，種板密度為2.5×104個·mL－1較好。

圖3 不同種板密度A549生長曲線情況

4 討論

由Mosmann創(chuàng)立的MTT法能精確測定細胞活性，可用于藥物對細胞的殺傷效果研究及細胞株的藥敏實驗。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物Formazan并沉淀在活細胞中，F(xiàn)ormazan溶解于DMSO中變成紫紅色溶液，其顏色與活細胞成正比，因此測定其OD值即可間接反映活細胞的數(shù)量，從而反映藥物的敏感結(jié)果。MTT法操作簡便、快速、經(jīng)濟，與臨床療效相關(guān)性好，該分析法于1991年被美國國立癌癥研究所（NCI）納入抗癌藥物篩選程序，廣泛應(yīng)用于細胞系的體外抗癌藥物篩選。Sargen［5］對此法的研究應(yīng)用，認為MTT法結(jié)果與化療敏感和耐藥有顯著的一致性，能為臨床個體選擇化療方案提供相對準確的依據(jù)，故MTT法藥敏試驗近幾年較廣泛應(yīng)用于臨床惡性腫瘤（如白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌）的化療藥敏檢測［6］。

調(diào)查數(shù)據(jù)表明，肺癌是死亡率最高的癌癥。肺癌死亡率中，女性約占11%，男性超過20%，而且在全球有增長趨勢。根據(jù)顯微鏡下癌細胞的外部特征，肺癌可以分為兩種不同類型：非小細胞肺癌（約占80%）和小細胞肺癌。目前，非小細胞肺癌患者中，可手術(shù)治療（Ⅰ、Ⅱ期患者）的僅為全部患者的15%～20%，約80%的患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期（Ⅲb、Ⅳ），已失去手術(shù)機會，僅靠化療及放射治療來改善生活質(zhì)量、延長生存期。在NSCLC的治療過程中，化療作為全身性治療手段在肺癌綜合治療中舉足輕重。各類化療藥物多具有不同程度的毒副作用，盲目使用則可能對部分病人不僅無效，還會造成不必要的損害，增加病人的經(jīng)濟負擔，因此迫切需要建立一套指導(dǎo)化療藥物選擇和預(yù)測化療方案效果的辦法，化療的體外藥敏試驗因此應(yīng)運而生。PTX被公認為人類當今和未來幾十年間最有效的抗腫瘤藥物之一，已被確定為NSCLC治療中的一線化療藥。盡管療效好，但因為其會帶來各種毒副作用，給廣大患者帶來很大痛苦。因此，化療藥物劑量在腫瘤的治療和改善預(yù)后方面是個重點。本實驗表明，PTX對A549細胞有明顯的抑制增殖作用。當藥物濃度逐漸增加時，此藥對腫瘤細胞的抑制率也隨之增加。當加入PTX作用24 h時，A549細胞隨著藥物劑量從

0.000 64μg·mL－1增加劑量至0.016μg·mL－1，抑制率由0.14%±5.88%升高至29.01%±7.80%，但當藥物劑量介于0.016～50μg·mL－1之間時，藥物的抑制效應(yīng)開始進入平臺期，除濃度0.000 64μg· mL－1組與其他7個濃度組和0.003 2μg·mL－1組與50μg·mL－1組比較有顯著性差異（P＜0.05）外，其余各組兩兩比較均無顯著性差異。提示臨床用藥時，在患者可以耐受的前提下，可適當提高藥物濃度，但是藥物濃度達到一定計量時，其抑制率就不會再有升高趨勢，反而給機體帶來各種毒副作用，因此臨床治療的合理紫杉醇用藥劑量對于肺癌患者是非常重要的。

MTT方法學(xué)尚無一個公認的統(tǒng)一的技術(shù)順序，作者在開展抗腫瘤藥物對細胞敏感性研究中發(fā)現(xiàn)，有很多因素會影響MTT的結(jié)果，如細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、培養(yǎng)板、DMSO對藍紫色結(jié)晶物Formazan的溶解情況等諸多因素。要優(yōu)化實驗結(jié)果，必須采用優(yōu)化的實驗條件和實驗數(shù)據(jù)。MTT法實驗條件和實驗數(shù)據(jù)的優(yōu)化處理：①種細胞和細胞密度的優(yōu)化處理：種細胞一定要確保細胞懸液均勻，種細胞密度要根據(jù)藥物作用的時間相應(yīng)的確定。以A549細胞為研究對象，通過實驗發(fā)現(xiàn)，用MTT比色法做紫杉醇作用24～72 h的體外抗腫瘤活性測試時，種板密度為4×104個·mL－1較好；作用72 h以上時，種板密度為2.5×104個·mL－1較好；②加MTT過程的優(yōu)化處理：加MTT溶液一定要迅速，盡量減少細胞在空氣里的暴露時間，減小外界因素對細胞狀態(tài)的影響；③MTT液更換的優(yōu)化處理：吸液時盡量傾斜培養(yǎng)板，吸頭位于培養(yǎng)孔側(cè)壁吸液，盡量少的吸走貼壁細胞；④培養(yǎng)板不能重復(fù)使用，可以通過顯微鏡觀察DMSO對藍紫色結(jié)晶物Formazan的溶解情況。

MTT法是一種能客觀反映細胞活力的細胞活性生化方法。MTT法優(yōu)點雖多，同時也存在一些問題：①有學(xué)者認為MTT法不能區(qū)分細胞抑制和細胞殺滅這兩種效應(yīng)；②MTT法體外藥敏試驗中的癌細胞為離體細胞，脫離了機體內(nèi)環(huán)境因素的作用?；谏鲜鲆蛩兀緦嶒炛荚趶囊粋€角度進行檢測，篩選出PTX有效作用于A549細胞的合適的濃度范圍。有利于在藥敏測定結(jié)果的指導(dǎo)下進行個體化化療，可以最大限度地發(fā)揮化療藥物對腫瘤細胞的殺傷能力，并避免不必要的藥物毒性，對于提高藥物的臨床療效具有一定的指導(dǎo)意義，可給臨床醫(yī)師提供選擇化療藥物的依據(jù)。

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M TT assay for detecting paclitaxel chemosensitivity on non small cell lung cancer

LI Peng-chong1，ZHAO Bo-xin2，LIANG Qian-ying2，CHEN Ru-da1，LI Guo-feng2

（1．People′s Hospital of Nanhai，Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528000，China；2．Department of Pharmacy of Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

ObjectiveTo assess the feasibility of MTT colorimetric assay for testing the in vitro chemosensitivity of non small cell lung cancer cells to paclitaxel（PTX）.MethodsA549 cells were exposed to paclitaxel at different concentrations or different treatment times，and then the growth－inhibiting effects were determined by MTT assay.ResultsPaclitaxel inhibited the growth of A549 cells significantly in time－and dose－dependent manners.ConclusionMTT assay may help select appropriate chemotherapeutic agents and provides evidence for individualized chemotherapy for non small cell lung cancer.

Non small cell lung cancer；Paclitaxel；MTT assay；A549 cells

R965

A

2095－5375（2014）01－0001－004

廣東省科技計劃項目（No.2010B030700014）

李鵬翀，男，研究方向：藥劑學(xué)，E－mail：chenruda123＠163.com

李國鋒，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物藥劑學(xué)，Tel：18666096038，E－mail：lgfnf＠fimmu.com