林蛙輸卵管總RNA提取方法的優(yōu)化及RT－PCR驗(yàn)證

李稼暉，劉回民，陳文超，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118）

總RNA提取是一個分離純化的過程，由于林蛙輸卵管組織包含大量分泌細(xì)胞，且細(xì)胞體積大，富含蛋白質(zhì)和膠原物質(zhì)，因此從林蛙輸卵管組織中提取高質(zhì)量總RNA的難度較大.RT－PCR驗(yàn)證是對總RNA質(zhì)量高低的直接評價.甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作為管家基因，在所有組織中都高豐度表達(dá)，在同種細(xì)胞或組織中的蛋白表達(dá)量基本恒定，因此可作為RT－PCR的內(nèi)參基因.延伸因子（elongation factors，EF）是在mRNA翻譯時促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子，延伸因子在各種組織中都較高水平地表達(dá)，并且相近物種間保守性較強(qiáng)，也適合作為RT－PCR的內(nèi)參基因.

為提高總RNA得率和完整性，本文通過對已有方法的改良和優(yōu)化獲得了高純度的RNA，并比較3種不同試劑對林蛙輸卵管組織總RNA的提取效果，確定RNAiso Plus為最佳裂解劑.先對其操作過程、用量和裂解時間等進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步純化后，再對GAPDH及EF－1－α基因片段進(jìn)行RT－PCR，并驗(yàn)證該方法提取的總RNA質(zhì)量.

1 材料與方法

1.1 林蛙輸卵管組織的獲取

將2013年3月初捕獲的長白山地區(qū)雌性林蛙（3～5年）解剖，取其輸卵管，剪成小段置于2.0mL離心管中，用液氮冷凍處理，－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試 劑 TRIzol購自美國Invitrogen公司；RNAiso Plus，DNA Marker2000，PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Taq DNA Polymerase購自日本TaKaRa公司；焦炭酸二乙酶（DEPC）購自北京鼎國生物有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇、檸檬酸鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、酚、醋酸鈉和異戊醇均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2.2 儀 器 EPS 301型電泳儀（美國GE公司）；FRESCO17型高速低溫離心機(jī)（美國Therom Fisher Scientific公司）；NanoDrop 2000型微量紫外分光光度計（美國Therom Fisher Scientific公司）；AG 22331Hamburg型PCR儀（德國Eppendorf公司）；K20型金屬浴（杭州奧盛儀器公司）.

1.3 方 法

1.3.1 裂解劑的選擇 分別使用 TRIzol法［16］、RNAiso Plus法［17］和改良的CTAB［18］法進(jìn)行總 RNA提取，比較提取效果，選擇最佳的提取方法并進(jìn)一步改良.

1.3.2 改良RNAiso Plus法的建立及條件優(yōu)化 以RNAiso Plus法為基礎(chǔ)，進(jìn)行如下改良：1）液氮研磨過程中，在液氮未揮發(fā)完前進(jìn)行粗粉碎，液氮揮發(fā)完后立刻細(xì)磨組織4～6s，迅速補(bǔ)充液氮，重復(fù)2～3s，至組織充分粉碎；2）加入RNAiso Plus完全覆蓋組織粉末，當(dāng)凝固的RNAiso Plus試劑融化至研杵可輕輕碰碎的程度時，立即攪動，使底部組織與RNAiso Plus試劑充分混勻，完全融化后繼續(xù)研磨5min；3）將離心除去組織沉淀過程中處于中部黏稠的膠原層轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中；4）沉淀總RNA過程選擇V（異丙醇）∶V（鹽溶液）＝4∶3為沉淀劑（鹽溶液為0.8mol／L檸檬酸鈉和1.2mol／L NaCl混合液）.

在每0.1g組織中加入梯度增加的RNAiso Plus試劑，裂解時間20min；在每0.1g組織中加入2.2mL RNAiso Plus試劑，靜置裂解反應(yīng)時間為梯度增加.以此確定RNAiso Plus最佳添加量和最佳裂解時間.

小說的要義不在于準(zhǔn)確無誤地臨摹生活，卻可在一定程度上反映社會現(xiàn)實(shí)。 自道教的風(fēng)水學(xué)說傳入朝鮮半島，與當(dāng)?shù)亓鱾鞯乃_滿信仰結(jié)合后，形成了具有朝鮮民族特色的民俗文化。 這些民俗文化和人文觀念在以堪輿為主題的漢文小說中也可見一斑。 朝鮮半島的堪輿風(fēng)俗和社會觀念影響了其小說創(chuàng)作，致使大批以堪輿為主題的漢文小說應(yīng)運(yùn)而生，同時，這些堪輿主題的漢文小說也在一定程度上反映了朝鮮半島的喪葬民俗和人文觀念。

1.3.3 總RNA的純化 將總RNA 52.0μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1‰的DEPC水10.0μL，10×PCR緩沖溶液8.0μL，DNase 10.0μL置于0.5mL離心管中，輕輕混勻后置于37℃金屬浴中，反應(yīng)20min；加入100μL體積分?jǐn)?shù)為1‰的DEPC水，90μL酚和90μL氯仿，充分混勻置于4℃離心機(jī)中，靜置10min，13 500r／min離心10min；將上清液置于1.5mL EP管中，加入無水乙醇使其體積分?jǐn)?shù)為25%，靜置5min，于4℃，13 500r／min離心5min，再將上清液置于新EP管中；加入等體積異丙醇沉淀，混勻后靜置5min，于4℃，13 500r／min離心10min；用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌沉淀1～2次；除去乙醇，用50μL DEPC水復(fù)溶，于－80℃保存.

1.3.4 總RNA的質(zhì)量檢測 測定樣品A260和A280的吸光度值，計算A260／A280，將吸光度換算為質(zhì)量濃度并計算得率.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性.

1.3.5 總RNA穩(wěn)定性驗(yàn)證 將純化后的總RNA樣品分成兩組，一組于－80℃保存，另一組于密封的離心管中37℃放置2h，電泳鑒定其完整性.

1.3.6 RT－PCR檢測 根據(jù)蛙類的GAPDH基因（GenBank登錄號：NM＿001087098.1）和非洲爪蟾、日本雨蛙及中華大蟾蜍延伸因子基因（EF－1－α）中的高度保守序列（GenBank登錄號：BC041196，AB199910，AB066590）設(shè)計RT－PCR引物列于表1.按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明合成cDNA第一鏈.PCR反應(yīng)體系為：RT反應(yīng)液1μL，dNTP混合液2μL（2.5mmol／L），PCR緩沖液4μL，上下游引物各0.5μL（25μmol／L），Taq DNA聚合酶0.15μL，ddH2O 16.85μL.反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃ 30s，50 ℃（GAPDH）／55℃（EF－1－α）30s，72℃1min，循環(huán)30次，72℃延伸10min.

表1 RT－PCR引物Table 1 RT－PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳方法的確定

將林蛙的輸卵管組織分別使用不同方法進(jìn)行總RNA提取，每次做3個平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示.由圖1（A）可見：改良的CTAB法提取RNA導(dǎo)致基因組DNA污染較大，并伴隨較大程度的降解；TRIzol法與RNAiso Plus法提取效果相近，由5S條帶相對亮度均過高可知存在一定程度的降解.由圖1（B）可見，5S條帶相對亮度顯著降低，28S相對18S條帶亮度升高，表明經(jīng)改良的RNAiso Plus法相對其他方法在保持總RNA完整性方面效果最佳.

圖1 不同方法提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 AGE of total RNA extraction with different methods

不同方法提取總RNA的A260／A280及得率如圖2所示.由圖2可見，改良后的RNAiso Plus法相對改良前提取的總RNA得率增大，純度變化較小.其中改良CTAB法的高得率和高A260／A280值為DNA殘留所致.

綜上可見，改良的RNAiso Plus法是林蛙輸卵管總RNA提取的最佳方法.原因如下：1）充分粉碎.先在液氮中對組織進(jìn)行粗粉碎，待液氮揮發(fā)后，溫度上升使組織略膨脹，與研缽摩擦力增大，再繼續(xù)細(xì)磨使組織充分粉碎（該步驟易使RNA因溫度過高而被內(nèi)源性RNA酶酶解，因此研磨后應(yīng)立即補(bǔ)充液氮）.2）加入裂解劑后，縮短組織解凍時間.若待裂解劑完全融化再研磨，則底部的高膠原蛋白組織小碎片易重新黏連而無法研碎，使組織不能充分裂解，因而要提前研磨.3）回收利用膠原層.裂解后離心產(chǎn)生的膠原層是由于膠原蛋白大量吸水所致，因此形成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中含有大量的RNA，應(yīng)與上清液一同進(jìn)行氯仿分相，加氯仿后會使膠原變性失水并釋放所包含的RNA.

圖2 不同提取方法對總RNA質(zhì)量的影響Fig.2 Effects of different extracting agents on total RNA quality

2.2 裂解劑添加量對RNA提取的影響

圖3為不同RNAiso Plus添加量提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳.由圖3可見：當(dāng)每0.1g組織中裂解劑添加量小于1.6mL時，有基因組DNA污染；當(dāng)裂解劑添加量大于1.6mL時，基因組DNA被除去，且條帶亮度不斷提高.

圖4為不同RNAiso Plus添加量對總RNA質(zhì)量的影響.由圖4可見，除去DNA污染的組，裂解劑添加量為2.2mL時得率最高，此后A260／A280的值提高較小且得率降低，這是由于溶液體系增加，在沉淀過程中損失率相對提高所致.為了獲得更高的得率，選擇2.2mL作為裂解劑的最佳添加量.

圖3 不同RNAiso Plus添加量提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 AGE of total RNA extracted with different RNAiso Plus dosages

圖4 不同RNAiso Plus添加量對總RNA質(zhì)量的影響Fig.4 Effects of different RNAiso Plus dosages on total RNA quality

2.3 裂解時間對RNA提取的影響

圖5 不同裂解時間對總RNA提取影響的電泳Fig.5 Effect of different extracting time on total RNA extracted

圖5為不同裂解時間對總RNA提取影響的電泳.由圖5可見，隨著裂解時間的增加，條帶亮度不斷提高，當(dāng)裂解時間為30min時，RNA開始降解，這是因?yàn)榱呀鈺r間過長，RNA被內(nèi)源RNA酶逐漸酶解所致.圖6為不同裂解時間對總RNA質(zhì)量的影響.由圖6可見，增加裂解時間可提高總RNA的提取率，對A260／A280影響較小.為保證總RNA的完整性，選擇最佳裂解時間為25min.

2.4 總RNA純化

在每0.1g組織中添加2.2mL裂解劑，裂解時間為25min的條件下，提取的總RNA經(jīng)純化后的效果如圖7所示.由圖7可見，純化后泳道更清晰，表明酚和糖蛋白等污染已得到較大控制.

圖6 不同裂解時間對總RNA質(zhì)量的影響Fig.6 Effects of different extracting time on total RNA quality

圖7 純化前后的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 AGE of total RNA befor and after purified

圖8為總RNA的純化結(jié)果.由圖8可見，純化后總RNA的得率略下降，但A260／A280值提高較大，即純化效果較好.

圖8 總RNA的純化結(jié)果Fig.8 Purification of total RNA

2.5 RNA穩(wěn)定性驗(yàn)證

提取的總RNA在37℃放置2h后的電泳條帶清晰完整，與－80℃保存效果基本一致，表明提取的總RNA質(zhì)量較高，未受RNase污染，利于保存及后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖9 林蛙GAPDH基因及EF－1－α基因片段的RT－PCRFig.9 RT－PCR of GAPDHand EF－1－α gene of R.chensinensis

2.6 RT－PCR驗(yàn)證

圖9為林蛙GAPDH基因及EF－1－α基因片段的RT－PCR.由圖9可見，二者條帶清晰，無非特異性擴(kuò)增，條帶的分子量與理論P(yáng)CR產(chǎn)物大小相符，表明提取的總RNA滿足RT－PCR條件，可用于對林蛙輸卵管組織中mRNA的反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

綜上所述，本文經(jīng)改良提取方法、條件優(yōu)化及進(jìn)一步純化，提取林蛙輸卵管組織總RNA的A260／A280平均值為1.96，平均得率為56.1μg／g，與未優(yōu)化相比，得率和質(zhì)量均提高較大.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNA穩(wěn)定性良好；經(jīng)RT－PCR驗(yàn)證，該方法提取的總RNA質(zhì)量可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.

［1］關(guān)豐睿.林蛙油低脂酸奶的研制 ［D］.長春：吉林大學(xué)，2013.（GUAN Fengrui.The Development of Low Fat Set－Yogurt ContainingOviductusranae［D］.Changchun：Jilin University，2013.）

［2］陳曉平，崔敬愛，胡耀輝.林蛙油主要營養(yǎng)成分的研究 ［J］.食品科學(xué)，2005，26（8）：361－363.（CHEN Xiaoping，CUI Jing’ai，HU Yaohui.Study on the Mutrients ofOviductusranse［J］.Food Science，2005，26（8）：361－363.）

［3］藍(lán)晶晶.林蛙油抗氧化肽的制備及其抗氧化活性的研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2012.（LAN Jingjing.Preparation of Peptides from Enzvmic Hvdrolvsates ofOviductusranaeand Its Antioxidant Properties［D］.Beijing：Beijing Forestry University，2012.）

［4］鄭明珠，方麗，呂萍，等.長白山林蛙輸卵管糖蛋白的分離鑒定 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2011，49（2）：336－339.（ZHENG Mingzhu，F(xiàn)ANG Li，Lü Ping，et al.Separation and Identification ofRanacChangbaishanensisOviduct Glycoprotein［J］.Journal of Jilin University：Science Edition，2011，49（2）：336－339.）

［5］劉金亮，郭艷梅，鄭明，等.核盤菌子囊盤cDNA文庫的構(gòu)建、EST序列分析與SsMADS基因的篩選［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2010，48（4）：694－698.（LIU Jinliang，GUO Yanmei，ZHENG Ming，et al.Construction of cDNA Library from Apothecium ofSclerotiuiasclerotiorumIdentification ofSsMADSGene by EST Sequencing ［J］.Journal of Jilin University：Science Edition，2010，48（4）：694－698.）

［6］姜春來，馬紅霞，于湘暉，等.鼠白細(xì)胞介素15真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及活性鑒定 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2005，43（2）：238－240.（JIANG Chunlai，MA Hongxia，YU Xianghui，et al.Cloning and Expression of Recombinant IL－15and Bioactivity Assay［J］.Journal of Jilin University：Science Edition，2005，43（2）：238－240.）

［7］Vuylsteke M，Peleman J D，Eijk M J，van.AFLP－Based Transcript Profiling（cDNA－AFLP）for Genome－Wide Expression Analysis［J］.Nature Protocols，2007，2（6）：1399－1413.

［8］Sharkey F H，Banat I M，Marchant R.A Rapid and Effective Method of Extracting Fully Intact RNA from Thermophilic Geobacilli That Is Suitable for Gene Expression Analysis［J］.Extremophiles，2004，8（1）：73－77.

［9］McKenna L A，Gehrsitz A，S?der S，et al.Effective Isolation of High－Quality Total RNA from Human Adult Articular Cartilage［J］.Analytical Biochemistry，2000，286（1）：80－85.

［10］Coombs N J，Gough A C，Primrose J N.Optimisation of DNA and RNA Extraction from Achival Formalin－Fixed Tissue［J］.Nucleic Acids Research，1999，27（16）：12－17.

［11］Schultz D J，Craig R，Cox－Foster D L，et al.RNA Isolation from Recalcitrant Plant Tissue［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1994，12（4）：310－316.

［12］李箐芳，黃劭毅，田仁鵬，等.一種適用于RT－PCR的杉樹類植物中總RAN提取的方法 ［J］.武漢植物學(xué)研究，2004，22（6）：551－556.（LI Jingfang，HUANG Shaoyi，TIAN Renpeng，et al.An Improved Method Suited to Extract Total RNA Used to RT－PCR from Fir Plant［J］.J Wuhan Bot Res，2004，22（6）：551－556.）

［13］張哲文.中國林蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究 ［D］.大連：遼寧師范大學(xué)，2010.（ZHANG Zhewen.Research on Gene Expression and Proteomics of Chinese Brown Frog（Ranachensinensis）Skin［D］.Dalian：Liaoning Normal University，2010.）

［14］李苗，張育輝.DEHP對中國林蛙精巢中StAR、CYP17和CYP19基因表達(dá)的影響 ［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（7）：1785－1790.（LI Miao，ZHANG Yuhui.Effects of Di－2－ethylhexyl Phthalate（DEHP）on the Expression ofStAR，CYP17，andCYP19inRanachensinensisTestis［J］.Chinese Journal of Ecology，2012，31（7）：1785－1790.）

［15］周旋，肖向紅，張晶鈺，等.虹彩病毒脅迫下東北林蛙NF－κB和I－κB的差異表達(dá) ［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，41（10）：108－111.（ZHOU Xuan，XIAO Xianghong，ZHANG Jingyu，et al.Expression Analysis ofNF－κBandI－κBof RGV－StressedRanadybowskii［J］.Journal of Northeast Forestry University，2013，41（10）：108－111.）

［16］Simms D，Cizdziel P E，Chomczynski P.TRIzol：A New Reagent for Optimal Single－Step Isolation of RNA ［J］.Focus，1993，15（4）：532－535.

［17］Ma X B，Yang J.An Optimized Preparation Method to Obtain High－Quality RNA from Dry Sunflower Seeds［J］.Genet Mol Res，2011，10（1）：160－168.

［18］左欣欣，陳澤宇，馬騰，等.從動物組織中提取總 RNA的 CTAB 法 ［J］.中國西部科技，2011，10（2）：35－37.（ZUO Xinxin，CHEN Zeyu，MA Teng，et al.A Modified CTAR Method to Extract Total RNA from Animal Tissues［J］.Science and Technology in Western China，2011，10（2）：35－37.）