鴨疫里默菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

吳彩艷，鄒秀娟，戚南山，廖申權(quán)，李 娟，溫列娜，呂敏娜，孫銘飛＊

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東廣州510640；2.廣東天農(nóng)食品有限公司，廣東清遠(yuǎn)511827）

鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）所引起的對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一［1］。目前，對(duì)于該病的防治主要是疫苗免疫與藥物治療相結(jié)合的方法。由于RA的血清型有21個(gè)，且各型之間幾乎無(wú)交叉保護(hù)［2］，致使研制保護(hù)多種血清型的疫苗存在困難，因此藥物仍是防控本病的主要方法。由于抗菌藥物的廣泛及不合理使用，RA的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重［3-4］。而新藥研發(fā)速度緩慢，因此必須對(duì)現(xiàn)有藥物合理配伍使用以延緩其耐藥性。根據(jù)藥理學(xué)的研究，有些藥物合用可以增強(qiáng)抑菌效果。本研究所使用的阿莫西林和舒巴坦就具有協(xié)同作用，其中阿莫西林是廣譜青霉素類，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性（主要是因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶易被水解），而舒巴坦本身只有微弱的抗菌活性，但具有強(qiáng)大的廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制作用，可保護(hù)阿莫西林免遭β-內(nèi)酰胺酶水解而降低抗菌活性，兩者合用具有良好的協(xié)同作用，抗菌譜擴(kuò)大且抗菌作用增強(qiáng)［5］，對(duì)耐藥菌的作用也顯示了與敏感菌同等的效力。本研究測(cè)定了阿莫西林單一藥物及阿莫西林和舒巴坦復(fù)合劑對(duì)阿莫西林敏感和耐藥的RA的最低抑菌濃度（MIC），檢測(cè)復(fù)合劑的抑菌狀況及確定最佳配比。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本 病料采自廣東省肇慶和陽(yáng)江2個(gè)規(guī)?；唸?chǎng)的3周齡商品鴨，鴨場(chǎng)發(fā)病率均在70%以上。病鴨臨床癥狀主要表現(xiàn)下痢、頭頸震顫、共濟(jì)失調(diào)，病理變化主要為典型的纖維素性肝周炎、心包炎、氣囊炎等。各場(chǎng)分別采集10只病鴨或?yàn)l死鴨，無(wú)菌采集其腦、肝臟和心臟等病料。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，含50mL/L小牛血清）、胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA，含50mL/L小牛血清）、麥康凱培養(yǎng)基、按細(xì)菌學(xué)常規(guī)方法配制；微量生化發(fā)酵管，為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥物種類包括阿莫西林、恩諾沙星、頭孢噻吩、利福平、氨芐青霉素、頭孢曲松鈉、多黏菌素B、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特靈、慶大霉素、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明。阿莫西林粉劑（藥物有效力70%），為山西恒豐強(qiáng)藥業(yè)產(chǎn)品；舒巴坦粉劑，為山東久隆精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；RA定型血清，由廣東省農(nóng)科院動(dòng)物衛(wèi)生研究所寄生生物研究室保存的RA1-6和8、10型標(biāo)準(zhǔn)菌株，并以這些參考菌株免疫兔子制備。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 1日齡商品代櫻桃谷肉鴨50只，由廣州郊區(qū)某鴨場(chǎng)提供，未接種任何疫苗和抗血清。飼養(yǎng)于無(wú)RA污染的環(huán)境中。

1.1.4 菌液的制備 將分離株進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接種于TSB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，利用平板表面散步法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后用生理鹽水將菌液稀釋成2×108cfu/mL備用。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離與鑒定

1.2.1.1 病原的分離 無(wú)菌方法取上述病死鴨的肝臟、心臟和腦，劃線接種于TSA平板和麥康凱瓊脂平板，于37℃燭缸中培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.1.2 涂片染色鏡檢 挑取純培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行革蘭染色和瑞特染色，鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特性。

1.2.1.3 生化試驗(yàn) 將上述分離菌的純培養(yǎng)物分別接種于各種微量生化發(fā)酵管，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后觀察并記錄結(jié)果。

1.2.1.4 PCR鑒別診斷方法 按文獻(xiàn)［6］報(bào)道方法，將上述分離菌株的純培養(yǎng)物用種特異性PCR方法進(jìn)行分子鑒定。

1.2.1.5 動(dòng)物接種試驗(yàn) 將上述分離的純培養(yǎng)物經(jīng)病原學(xué)檢查、形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)診斷鑒定為RA的菌株接種于TSB培養(yǎng)基。以無(wú)菌生理鹽水將RA稀釋成1×108cfu/mL的細(xì)菌懸液，肌肉注射7d雛鴨，1mL/只，每組10只，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)，觀察致病力。

1.2.2 血清型鑒定 按文獻(xiàn)［5］報(bào)道的方法對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)紙片法進(jìn)行，即用滅菌棉拭子沾取菌液，在TSA平板上均勻涂布，待平板面稍干，用滅菌鑷子將上述藥敏紙片平放在板上，然后將平板于37℃培養(yǎng)18h～24h，測(cè)量并記錄各分離株抑菌圈的直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度的測(cè)定（MIC） 以試管兩倍稀釋法［7］略加改動(dòng)測(cè)定最低抑菌濃度，取帶蓋的滅菌試管10支為一列，每只試管添加TSB 1mL，于第1支試管中添加0.4mL的待測(cè)藥物，混勻后取出1mL加入第2支試管，以后以此類推至第8支試管，混勻后吸取1mL棄掉，第9支試管為不加藥物的陽(yáng)性對(duì)照，向以上第1支試管～第9支試管中各加入1mL稀釋的菌液，第10支試管為不加藥物和菌液只加生理鹽水的的陰性對(duì)照。用此方法評(píng)價(jià)阿莫西林及阿莫西林（AMC）/舒巴坦（SBT）不同配比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）對(duì)臨床分離的ZQ株和 YJ株的體外抗菌活性。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，針對(duì)RA（ZQ株）配置阿莫西林與舒巴坦貯存液濃度均為1 280μg/mL。分兩列進(jìn)行，第1列，第1支試管～第8支試管藥物終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL，第2列，第1支試管～第8支試管藥物終濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.03、0.015、0.072 5、0.003μg/mL；針對(duì) RA（YJ株）配置阿莫西林與舒巴坦貯存液濃度均為12 800μg/mL，第1支試管～第8支試管藥物終濃度分別為1 280、640、320、160、80、40、20、10μg/mL。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

2.1.1 培養(yǎng)特性 2個(gè)分離株在TSA平板上均生長(zhǎng)光滑、濕潤(rùn)、半透明的奶油狀菌落，而麥康凱平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.1.2 生化試驗(yàn) 2個(gè)分離株均不發(fā)酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇；不產(chǎn)生硫化氫，不利用檸檬酸鹽；甲基紅試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性；氧化酶、過(guò)氧化物酶試驗(yàn)陽(yáng)性。

2.1.3 PCR反應(yīng)結(jié)果 通過(guò)特異性PCR擴(kuò)增，2個(gè)分離株均擴(kuò)增到300bp大小的條帶，與目的條帶大小一致（圖1）。

圖1 分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of isolates by PCR

2.1.4 動(dòng)物接種試驗(yàn) 2個(gè)分離株對(duì)雛鴨均有不同程度的致病力，接種后3d剖檢可見(jiàn)典型的鴨傳染性漿膜炎的病理變化，發(fā)病率100%，致死率分別為70%和80%。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定從2個(gè)鴨場(chǎng)共分離鑒定到2株RA，分別命名為ZQ株和YJ株。

2.2 血清型鑒定結(jié)果

根據(jù)玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果確定2株RA均為血清1型。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

RA（ZQ株）對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、利福平、氨芐青霉素、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟敏感，對(duì)多黏菌素B、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特靈、慶大霉素、復(fù)方新諾明和恩諾沙星耐藥；RA（YJ株）對(duì)氟苯尼考、多黏菌素B、氨芐青霉素、氧氟沙星、痢特靈敏感，對(duì)阿莫西林、恩諾沙星、頭孢噻吩、利福平、頭孢曲松鈉、慶大霉素、頭孢噻肟和復(fù)方新諾明耐藥。

2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

陽(yáng)性對(duì)照管有細(xì)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，澄清透明，說(shuō)明對(duì)照成立。阿莫西林單一作用對(duì)其敏感的ZQ株 MIC值為0.5μg/mL，而復(fù)合劑AMC/SBT 1∶1配 比 的 MIC值 為0.007 25μg/mL，2 ∶ 1 配 比 的 MIC 值 為0.062 5μg/mL，4 ∶ 1 配 比 的 MIC 值 為0.25μg/mL，為3∶1配比的2倍。阿莫西林單一作用對(duì)其耐藥的YJ株MIC值為640μg/mL，復(fù)合劑 AMC/SBT 1∶1、2∶1配比的 MIC值均為20μg/mL，而4∶1配比的 MIC值為80μg/mL，為3∶1配比的2倍（表1）。

可見(jiàn)，阿莫西林與舒巴坦復(fù)合劑對(duì)RA分離株體外抗菌活性優(yōu)于阿莫西林單獨(dú)作用，表現(xiàn)出明顯的體外協(xié)同作用，對(duì)敏感的ZQ株，協(xié)同作用可以進(jìn)一步縮小MIC值；對(duì)耐藥的YJ株，協(xié)同作用可以減少耐藥性的產(chǎn)生，使抗性藥物繼續(xù)發(fā)揮療效。另外，考慮到臨床用藥成本，既保證藥物效果又可降低舒巴坦的用量，建議臨床用藥以AMC/SBT 2∶1配比為最佳。

表1 MIC測(cè)定結(jié)果Table 1 The result of MIC determination

3 討論

鴨疫里默菌與其他細(xì)菌一樣，由于藥物的長(zhǎng)期使用甚至濫用，導(dǎo)致耐藥性問(wèn)題異常突出，甚至到了無(wú)藥可用的地步。吳彩艷等［8］曾對(duì)廣東地區(qū)86株RA進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中77.91%～82.55%的菌株對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、氨芐青霉素、氟苯尼考敏感，但大多數(shù)菌株對(duì)其他9種常用抗菌藥物具有明顯抗性，并具有多重耐藥傾向。謝永福等［9］對(duì)來(lái)自珠三角地區(qū)87株RA進(jìn)行耐藥性分析，顯示大多數(shù)菌株對(duì)常用抗生素類藥物具有較強(qiáng)的耐藥性。吳華等［10］根據(jù)臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為由于大量抗生素和抗菌藥物用于治療鴨傳染性漿膜炎，造成RA耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，交叉耐藥狀況明顯。

究竟細(xì)菌的耐藥性是如何產(chǎn)生的，劉佳麗等［11］將細(xì)菌的耐藥機(jī)制分為自發(fā)性基因突變和耐藥基因摻入，細(xì)菌耐藥基因不僅由其染色體攜帶，還常由染色體外的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子攜帶，通過(guò)融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化在不同種屬的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或聚集重排造成多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升。Hu Q H等［12］發(fā)現(xiàn)，RA中的生物膜對(duì)抗生素和去污劑有很好的抵抗作用，認(rèn)為生物膜的產(chǎn)生是造成RA持續(xù)感染的重要因素。

本研究突破了以往將疾病的防控寄希望于新藥的研制上，而是在原有藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)行重新利用，既節(jié)約了研發(fā)成本又節(jié)省了新藥上市的時(shí)間。通過(guò)阿莫西林與舒巴坦的協(xié)同作用，增強(qiáng)了阿莫西林的抗菌活性，恢復(fù)了耐藥菌株對(duì)阿莫西林的敏感性。原因是舒巴坦能迅速貫穿細(xì)菌細(xì)胞壁并不可逆地破壞β-內(nèi)酰胺酶，抑制劑清除后也不能使酶的活性得到恢復(fù)，并且這種抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，從而使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)阿莫西林的敏感性。受此啟發(fā)，在當(dāng)前RA耐藥性嚴(yán)重的情況下，熟練運(yùn)用藥物的協(xié)同作用，將為臨床上防控鴨傳染性漿膜炎帶來(lái)良好效果。

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