布魯菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒的研制

李秀梅，郭 戀，梁智選，李 穎，郭立力，石 瑜，朱雅寧，王紅軍

（1.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300384）

布魯菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒的研制

李秀梅1，郭 戀1，梁智選1，李 穎1，郭立力1，石 瑜1，朱雅寧1，王紅軍2＊

（1.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300384）

利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)建立布魯菌的檢測方法。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，組裝布魯菌LAMP檢測試劑盒，并對試劑盒的各項(xiàng)性能進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，該試劑盒適用于布魯菌的快速檢測，在63℃條件下1h內(nèi)可檢出布魯菌，其檢測限達(dá)5copies／μL，特異性為100%，無假陽性和假陰性出現(xiàn)。反復(fù)凍融20次或－20℃下貯存1年，均不影響試劑盒的使用效果。對牛奶樣品的檢測結(jié)果顯示，陽性檢出率為3.33%，與奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)（NY／T1467－2007）的檢測結(jié)果相符。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可滿足大批量樣品快速篩選的要求。

布魯菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測試劑盒；Omp25基因

布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）引起的一種變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病，嚴(yán)重地威脅著多種動(dòng)物和人的健康，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害。我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫病，衛(wèi)生部將其列為乙類傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病［1］。布魯菌在自然環(huán)境中生活力較強(qiáng)，在病畜的分泌物、排瀉物及死畜的臟器中能生存4個(gè)月左右，在食品中約生存2個(gè)月。羊、牛、豬是其主要宿主，羊、牛、豬及其畜產(chǎn)品與人類接觸密切，從而增加了人類感染的機(jī)會，因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是保證人類和動(dòng)物生命安全的重要手段。

目前，用于布魯菌常規(guī)的檢測方法有細(xì)菌分離培養(yǎng)、血清凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和PCR等方法，但花費(fèi)時(shí)間較長，而且判定結(jié)果需要借助精密儀器設(shè)備，難以在基層生產(chǎn)中普及應(yīng)用，因此，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的病原診斷方法顯得十分必要。Notomi T等［2］于2000年發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP），該技術(shù)依賴4條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列。目前，對于LAMP研究多集中在檢測方法建立階段，真正建立有實(shí)際應(yīng)用的LAMP檢測試劑盒卻鮮有報(bào)道。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測布魯菌的試劑盒并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，為監(jiān)測畜產(chǎn)品的生物安全及獸醫(yī)臨床快速準(zhǔn)確地診斷布魯菌提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

BstDNA聚合酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、Mg－SO4為紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、全血基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Betaine Solution（甜菜堿）、鈣黃綠素為SIGMA公司產(chǎn)品；布魯菌弱毒疫苗（S2株）為中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠產(chǎn)品；胎兒彎曲菌、大腸埃希菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌菌株為廣州粵晨生物科技有限公司提供；羊、牛、豬、犬種布魯菌基因組核酸由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 4.0（http：／／primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan），針對布魯菌保守的 Omp 25基因設(shè)計(jì)了4條LAMP的特異性引物，包括2條外引物（F3和B3）以及2條內(nèi)引物（FIP和BIP）。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 陽性對照品的制備 將外引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒純化后，克隆到載體pMD 19-T上，經(jīng)PCR及測序分析后，提取質(zhì)粒DNA作為陽性對照。測定其濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù)。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.2.3 試劑盒的組裝 試劑盒組成（48個(gè)反應(yīng)／盒）。使用方法如下：①配制反應(yīng)體系25μL／LAMP：2μL布魯菌LAMP檢測混合液1，3.5μL布魯菌LAMP檢測混合液2，7.5μL布魯菌LAMP檢測混合液3，1μLBstDNA聚合酶、補(bǔ)充無菌水至23μL，加入2μL待檢樣品或陰、陽性對照品。②在恒溫水浴鍋、恒溫金屬浴、PCR反應(yīng)儀及濁度儀等可恒溫設(shè)備上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件：63℃恒溫反應(yīng)60min。

1.2.4 試劑盒檢測參數(shù)的評價(jià)

1.2.4.1 特異性 將提取的布魯菌（羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌）與非布魯菌菌株（胎兒彎曲菌、大腸埃希菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌）基因組DNA各取2.0μL作為模板，用本研究研制的試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.4.2 靈敏度 將布魯菌弱毒疫苗（S2株）DNA模板定量后分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取2.0μL作為模板，用試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.4.3 重復(fù)性 采用本研究建立的試劑盒對羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌的基因組DNA分別進(jìn)行3次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.5.1 保存期 將本研究研制的試劑盒置于－20℃冷凍保存，每隔3個(gè)月取出3個(gè)不同批次的試劑盒各1盒，分別對試劑盒中的陰、陽性對照品以及羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌的基因組DNA進(jìn)行檢測。

1.2.5.2 反復(fù)凍融試驗(yàn) 將試劑盒由－20℃取出，置室溫下溶解，再置－20℃冷凍，如此反復(fù)分別經(jīng)凍融5、10、15、20、25次后，對試劑盒陰、陽性對照品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

1.2.6 樣品采集 牛奶樣品為天津市奶牛養(yǎng)殖場產(chǎn)品，共采集60份。

1.2.7 臨床樣本檢測 采集的牛奶樣品共60份，使用全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用本研究研制的試劑盒進(jìn)行檢測，并與奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)（NY／T1467－2007）檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 重組陽性對照品的克隆測序

構(gòu)建的試劑盒陽性對照經(jīng)北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，序列大小為228bp，與設(shè)計(jì)一致。將此序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果表明，該序列與GenBank上所有的布魯菌Omp 25基因同源性大于98%。

2.2 特異性

選取布魯菌LAMP引物分別對布魯菌菌株（羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌）與非布魯菌菌株（胎兒彎曲菌、大腸埃希菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌）的基因組DNA進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。經(jīng)LAMP試劑盒檢測，羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌反應(yīng)管為特異性綠色，其余反應(yīng)管均為橙色，如圖1所示。

2.3 靈敏度

應(yīng)用試劑盒對布魯菌弱毒疫苗（S2株）各個(gè)稀釋度基因組DNA提取液進(jìn)行檢測后，如圖2所示，稀釋度為101～106倍時(shí)，反應(yīng)管均顯示特異的綠色，107稀釋度和空白對照管均為橙色。按拷貝數(shù)計(jì)算，該試劑盒最低檢測限可達(dá)到大約5copies／μL的水平。

2.4 重復(fù)性

以羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌基因組DNA作為模板進(jìn)行3次重復(fù)性檢測，反應(yīng)管均呈特異的綠色，而陰性對照反應(yīng)管均呈橙色，表明該試劑盒具有良好的重復(fù)性。

2.5 穩(wěn)定性

2.5.1 保存期 每隔3個(gè)月取出貯存于－20℃的3個(gè)批次的試劑盒各1盒進(jìn)行LAMP檢測，連續(xù)檢測12個(gè)月。陰性對照反應(yīng)管均呈橙色，陽性對照和羊種布魯菌、牛種布魯菌、豬種布魯菌、犬種布魯菌基因組DNA的反應(yīng)管均呈特異性綠色。該試劑盒可在－20℃下保存1年。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of specificity test

圖2 試劑盒靈敏度測試Fig.2 The sensitivity test of the kit

2.5.2 反復(fù)凍融試驗(yàn) 試劑盒反復(fù)分別經(jīng)凍融5、10、15、20、25次后，對試劑盒陰、陽性對照品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，陰性對照反應(yīng)管均呈橙色，陽性對照反應(yīng)管均呈特異性綠色，該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性（圖3）。

圖3 試劑盒穩(wěn)定性測試Fig.3 The stability test of the kit

2.6 臨床樣本檢測

應(yīng)用該試劑盒通過對60份牛奶樣品進(jìn)行檢測，有2份樣品中檢出布魯菌，檢出率為3.33%，與奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)（NY／T1467－2007）檢測結(jié)果完全一致，但比奶牛布魯菌病PCR診斷技術(shù)（NY／T1467－2007）更快速和簡便。

3 討論

應(yīng)用LAMP技術(shù)等核酸分子生物學(xué)技術(shù)建立布魯菌特異性鑒定方法，靶基因的選擇和引物設(shè)計(jì)優(yōu)劣至關(guān)重要。本研究選擇的Omp25基因在布魯菌屬種間有很高的同源性，并且Omp25基因是布魯菌重要的毒力基因［3－6］。因此，本研究利用布魯菌Omp25基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Blastn和Clustal W比對分析，在理論上保證其特異性并位于Omp25基因保守區(qū)段，再經(jīng)對實(shí)際菌株樣本檢測進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，本研究建立的LAMP試劑盒能特異性的檢測和鑒定布魯菌，與非布魯菌（胎兒彎曲菌、大腸埃希菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌）無交叉反應(yīng)，具有很高的特異性，能夠有效的避免假陽性問題。

經(jīng)靈敏度試驗(yàn)，本研究建立的布魯菌LAMP檢測試劑盒檢測布魯菌基因組DNA靈敏度達(dá)到5copies／μL，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道中邱昌慶等［7］建立的套式PCR技術(shù)檢測布魯菌靈敏度50cfu／mL，徐軍等［8］建立的套式PCR檢測乳中布魯菌靈敏度40cfu／mL和張?zhí)璧龋?］建立的熒光定量PCR檢測牛布魯菌靈敏度50copies／μL；與文獻(xiàn)報(bào)道中吳中華等［10］建立的復(fù)合探針熒光定量PCR檢測布魯菌靈敏度 10copies／μL 和高正琴等［11］建立的TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測布魯菌靈敏度9.3copies／μL相當(dāng)。因此，本研究建立的試劑盒靈敏度高，能夠用于低污染量的樣品檢測。通過重復(fù)性、穩(wěn)定性等試驗(yàn)對本試劑盒的性能進(jìn)行評價(jià)，本試劑盒定性準(zhǔn)確、穩(wěn)定性及重復(fù)性好，而且LAMP檢測全過程（包括樣品前處理）可在2h內(nèi)完成，完全適合于布魯菌的快速檢測。另外，LAMP具有完全閉管檢測，不需PCR后處理等優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī)PCR反應(yīng)體系的不足［12］。所以，本研究建立的布魯菌LAMP快速檢測試劑盒適用于肉、奶、組織等多種樣品中布魯菌的快速初篩檢測，而進(jìn)一步優(yōu)化，裝配成試劑盒后，更能滿足基層實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模普查需要，有望得到進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。

［1］李長友，李 明.動(dòng)物布魯菌病防治指導(dǎo)手冊［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

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Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Kit for Detection ofBrucella

LI Xiu-mei1，GUO Lian1，LIANG Zhi-xuan1，LI Ying1，GUO Li-li1，SHI Yu1，ZHU Ya-ning1，WANG Hong－jun2

（1.TianjinAnimalDiseaseControlCenters，Tianjin，300402，China；2.TianjinAnimalHusbandryDevelopmentandServiceCenters，Tianjin，300384，China）

A loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for detection ofBrucellawas established.By optimization of the reaction conditions of LAMP，LAMP kit was assembled，meanwhile various performance were evaluated in this paper.The results showed that the kit was available to rapidly detectBrucella.TheBrucellacould be detected by the kit within 1hour at constant temperature of 63℃.Limit of detection was at the level of 5copies／μL and the specificity of the approach was 100%without any false negative or positive action.Besides，the kit worked well after being frozen-thawed for 20times or stored at－20℃for one year.The milk samples of the cows with brucellosis were detected with the developed method and PCR method，and the results showed that the coincidence rate of these two methods was 100%，postive detection rate was 3.33%.The detection kit developed in this study has good performances in specificity，sensiticity and stability etc and is suitable for the rapid screening of mass samples.

Brucella；loop-mediated isothermal amplification；detection kit；Omp25gene

S852.614

A

1007-5038（2014）07-0006-05

2014-01-02

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA101605）；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（10ZCZDNC02800）

李秀梅（1976－），女，黑龍江依安人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。＊通訊作者