CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進展

曾美秀(綜述)，蘇 萍(審校)

(浙江蕭山醫(yī)院血液科，杭州 311202)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是B細胞惡性腫瘤，以分泌異常單克隆免疫球蛋白的漿細胞在骨髓內大量增生、聚集和免疫功能障礙為特征。傳統(tǒng)的大劑量化療和自體造血干細胞移植可提高患者生存率，新的免疫治療策略中，獨特型疫苗和以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎的免疫治療呈現(xiàn)出有希望的前景，但目前仍難以治愈此疾病。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是一群具有免疫負調控功能的T細胞亞群，在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機體對自體同源腫瘤細胞的免疫，導致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸。該文就CD4+CD25+Tregs在MM中的研究進展予以綜述。

1 CD4+CD25+Tregs的生物學特性及作用機制

1.1CD4+CD25+Tregs的生物學特性 CD4+CD25+Tregs是Tregs中的重要群體，占人類和鼠外周血CD4+T細胞的5%～10%，在人類除表達CD25外，還組成性表達叉頭樣轉錄因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體、CD122、CD103，同時還可分泌轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素(interleukin,IL)10等[1]。其中，F(xiàn)OXP3特定表達在細胞內，是Tregs發(fā)育、活化、發(fā)揮功能的關鍵，并且不受活化狀態(tài)的影響，被公認為是Tregs的特異性標志，但近期研究發(fā)現(xiàn)許多活化的、不具有抑制功能的細胞也表達FOXP3，且還不清楚是否所有的表達FOXP3的T細胞都具有抑制功能[2]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)高表達于非調節(jié)性T細胞CD127在Tregs低表達，Hartigan-O′Connor等[3]用CD4、CD25、CD127三色抗體標記發(fā)現(xiàn)，人類、鼠及短尾猴外周血存在群體較清晰的CD4+CD25+/highCD127lowT細胞，它們高表達胞內FOXP3和CTLA-4，功能分析發(fā)現(xiàn)其具有抑制性、低增殖性和對T細胞受體信號的低反應性。CD4+CD25+Tregs可以分為兩大類：一類是天然存在的Treg，它是在胸腺內產(chǎn)生并生存在周圍組織中以阻止?jié)撛诘淖陨砻庖叻磻涣硪活愂钦T導產(chǎn)生的Treg，它的前體細胞也是從胸腺樣組織衍生而來，是在不完全暴露抗原刺激的特定條件下，由幼稚的細胞在體內周圍組織中激活后表達CD25分子而轉化為 CD4+CD25+Tregs。

CD4+CD25+Tregs具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征，前者對IL-2特異性抗原及抗原呈遞細胞的刺激呈低反應狀態(tài)；后者在T細胞受體介導的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖，且這種免疫抑制作用呈現(xiàn)主要組織相容性復合物非限制性及非抗原特異性。

1.2CD4+CD25+Tregs的作用機制 活化的CD4+CD25+Tregs可以廣泛抑制體內多種細胞的增殖，如CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、DC、單核巨噬細胞和自然殺傷細胞的活性[4]。其以一種主動的方式調控機體的免疫應答，對自身抗原和非己抗原均有較強的免疫抑制作用。目前對Tregs介導的免疫抑制的分子基礎還不是很清楚，認為可能通過以下幾種途徑發(fā)揮作用。

1.2.1細胞接觸的調節(jié) 研究證實，CD4+CD25+Tregs在體外主要通過細胞-細胞直接接觸的方式介導免疫抑制，而不依賴于細胞因子。中和TGF-β或IL-10作用免疫抑制不受影響，而將CD4+CD25+Tregs與CD4+CD25-反應性T細胞用半透膜隔離培養(yǎng)，則不能產(chǎn)生增殖抑制效應[5]。有趣的是，活化的CD4+CD25+Tregs經(jīng)多聚甲醛固定后依然能保持抑制活性，提示細胞表面高表達的某種分子可能參與了該免疫抑制作用[6]。隨后的研究表明，CTLA-4可能就是介導這種接觸抑制作用的重要分子[7]，其跨膜分子胞內段攜帶酪氨酸抑制基序，與B7配接后傳遞抑制信號，抑制T細胞的增殖和活化。另外，CTLA-4與DC表面的CD80/CD86結合，通過逆向轉導的信號導致DC內的吲哚氨-2，3-雙加氧酶(indole-ammonia-2,3-dioxygenase,IDO)活化，IDO是色氨酸代謝所必需的酶，由于IDO的活化，使游離的色氨酸減少，從而導致T細胞的活化程度降低[8]。此外，CD4+CD25+Tregs在淋巴結或腫瘤部位亦可通過穿孔素/顆粒酶、Fas/FasL途徑直接殺傷免疫效應細胞[9]。

1.2.2細胞因子介導的調節(jié) 研究表明，CD4+CD25+Tregs可通過分泌TGF-β，抑制CD8+T細胞和自然殺傷細胞對腫瘤的直接殺傷作用。CD8+T細胞表面存在TGF-β受體Ⅱ，與TGF-β結合后能激活胞內片段激酶結構域，隨即發(fā)生磷酸化，可進一步活化細胞內信號轉導蛋白家族，從而啟動相關基因表達，發(fā)揮抑制活性。Smyth等[10]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，無論是體內還是體外，Tregs都直接抑制了自然殺傷細胞激活性受體介導的自然殺傷細胞毒性作用，以此削弱對腫瘤細胞的殺傷。IL-10是介導Tregs免疫作用的另一個重要分子，其可通過抑制抗原呈遞細胞有效抑制IL-12的產(chǎn)生，而IL-12是輔助性T細胞分化的關鍵因子。此外，IL-10還可下調主要組織相容性復合物Ⅱ類分子、單核細胞CD80、CD86和CD28配體的表達及阻止T細胞受體介導的CD4+T細胞的活化。

另外，CD4+CD25+Tregs還可通過在效應T細胞活化早期抑制IL-2產(chǎn)生并導致其免疫無能，抑制免疫效應細胞向腫瘤微環(huán)境聚集等途徑，介導免疫抑制作用[11]。

2 CD4+CD25+Tregs與MM

2.1MM中Tregs的數(shù)量 近年研究已證實，一些實體性腫瘤(如胃癌、肺癌、肝癌等)中均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Tregs數(shù)量增加,并且Tregs數(shù)量增加程度與腫瘤進展及較差的預后相關。MM患者外周血Tregs與MM發(fā)病及預后亦有關，初治的MM患者外周血Tregs增多，而在癌前病變階段及緩解期的患者Tregs與正常人相比無顯著差異[12]。Beyer等[13]研究發(fā)現(xiàn)，意義未明單克隆免疫球蛋白血癥、MM患者外周血及骨髓CD4+CD25high/FOXP3+Tregs均較正常對照者顯著增高。韓文敏等[14]通過流式細胞術檢測外周血CD4+CD25highCD127lowTregs的結果與 Beyer等[13]的結果類似，且Ⅲ期較Ⅰ、Ⅱ期亦顯著升高。對于MM患者 CD4+CD25+Tregs增高的原因，Beyer等[13]通過對細胞表面免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，這些增高的Tregs并非因為胸腺產(chǎn)生過多，而是在外周循環(huán)擴增所致，至于是何種或哪些因素導致擴增，未進一步研究。韓文敏等[14]報道，MM患者血清TGF-β表達顯著升高，但與升高的CD4+CD25highCD127lowTregs并無明顯相關性,提示TGF-β并非MM患者體內Tregs增加的重要和唯一因素，可能與IL-10、血管內皮生長因子等因素有關，值得進一步研究。

2.2MM中Tregs的功能 研究表明，MM患者CD4+CD25+Tregs水平顯著增高，那么增高的CD4+CD25+Tregs免疫調節(jié)功能如何呢?Prabhala等[15]比較MM及正常對照者Tregs抑制可溶性CD3單抗誘導刺激外周血T細胞增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)MM患者Tregs的免疫抑制功能顯著減弱。而Beyer等[13]通過分析MM及正常者來源的高度純化的CD4+CD25highTregs對異基因混合淋巴細胞反應及CD3/CD28刺激的T細胞增殖抑制作用發(fā)現(xiàn)，兩組具有相同的抑制功能。分析比較上述研究的不同結果，可能與試驗中所選擇的方法不同有關，前者選擇的是外周血單個核細胞中僅除去CD25+的剩余細胞，而后者選擇的是高度純化的CD4+CD25highT細胞，這就排除了包含在外周血單個核細胞中的其他細胞作用的影響。Strauss等[16]報道，頭頸部鱗癌患者外周血單個核細胞及腫瘤浸潤性淋巴細胞中CD4+CD25+/highTregs顯著增高，比較兩種不同來源CD4+CD25highTregs的免疫抑制功能發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性淋巴細胞者對CD3/CD28誘導的免疫增殖抑制作用更強，且這種作用主要由自體T細胞分泌的TGF-β及IL-10介導，而不依賴于細胞接觸，但細胞接觸可對抑制作用進一步增強。總之，MM作為免疫效應細胞的腫瘤，免疫功能異常是導致其發(fā)生、發(fā)展的重要原因和嚴重后果，而MM患者體內異常的Tregs構成了腫瘤免疫耐受網(wǎng)絡的關鍵成分，可能是免疫抑制的重要原因。

2.3Tregs與MM免疫治療 近年來，隨著造血干細胞移植以及新藥(如硼替佐米、雷利度胺)的應用，MM患者的治療緩解率及生存時間得到了顯著提高，但腫瘤耐藥及復發(fā)仍是MM治療的一大困境。在MM新的免疫治療策略中，獨特型疫苗和以DC為基礎的免疫治療成為研究熱點，在大鼠模型研究中顯示，獨特型疫苗誘導產(chǎn)生了抗骨髓瘤的保護性免疫。Hansson等[17]應用MM患者自體M蛋白獨特型疫苗聯(lián)合粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及IL-2免疫Ⅰ～Ⅱ期MM患者，結果發(fā)現(xiàn)大部分受試者在誘導期均能產(chǎn)生獨特型特異性T細胞反應，而CD4+CD25+Tregs顯著升高的患者未產(chǎn)生，因此猜測可能是增高的CD4+CD25+Tregs免疫負調控抑制了獨特型免疫反應的產(chǎn)生。Tregs與DC之間也存在復雜的關系。體外研究中，成熟DC可有效擴增抗原特異性的Tregs，反過來，Tregs能夠抑制未成熟DC的抗原遞呈能力[18]。另外，Tregs的CTLA-4與DC表面 CD80/CD86結合，誘導DC上IDO的上調，抑制了T細胞增殖，誘導了T細胞凋亡[8]。熊紅等[19]及丁巖松等[20]報道，應用自體骨髓瘤細胞全抗原或M蛋白獨特型疫苗負載DC或糖基化修飾的DC疫苗都可以誘導有效的抗腫瘤免疫應答，并殺傷自體骨髓瘤細胞，顯示出明顯的抗骨髓瘤作用。然而相關臨床試驗效果卻令人大失所望，究其原因，可能是MM患者體內增高的Tregs導致DC功能抑制以及DC誘導Tregs擴增，減弱了以DC為基礎的免疫治療作用。

因此，如何抑制Tregs活化、增殖，提高免疫細胞的抗腫瘤免疫，是目前克服骨髓瘤耐藥及復發(fā)的重要手段之一[21]。目前用于清除或抑制Tregs作用的途徑主要有：①用特異性抗體或Ontak(一種IL-2與毒素的融合蛋白)清除CD25+Tregs；②FOXP3疫苗,小鼠模型顯示，該疫苗能活化FOXP3特異性的細胞毒性T細胞，從而清除Treg細胞，增強抗腫瘤作用[22]；③研究證實,CpG寡脫氧核苷酸(CpG oligonucleotide)能與人Tregs上的Toll樣受體8結合，通過Toll樣受體8-髓樣分化因子88-白細胞介素1受體相關激酶4信號通路來逆轉Treg的抑制作用[23]。但值得注意的是，這些方法大多為非特異性的，可將識別腫瘤抗原或自身抗原的CD4+CD25+Tregs全部抑制或去除，這也可能使機體罹患自身免疫性疾病。目前應用于MM治療的藥物(如環(huán)磷酰胺、氟達拉濱、雷利度胺等)均被證實具有清除MM患者Tregs的作用[24-25]。在對硼替佐米治療移植物抗宿主疾病研究中證實,其可通過抑制核因子κB通路抑制T細胞增殖、活化，對人體外周血Tregs有抑制、清除作用[26]。最近李瀅等[27]研究發(fā)現(xiàn),接受硼替佐米化療后,MM患者的Tregs水平下降更顯著，提示硼替佐米對MM患者的Tregs具有抑制作用，其通過解除機體免疫抑制的微環(huán)境來增強細胞免疫的抗腫瘤能力、重建細胞免疫間的平衡穩(wěn)態(tài)而達到良好地清除腫瘤的功能；而對于原發(fā)耐藥患者外周血Tregs的清除作用較少，化療療效不佳，提示抑制Tregs的增殖與功能仍是改善治療的關鍵因素之一。

3 結 語

MM至今仍難以治愈，嚴重危害人類健康，近年來隨著對其免疫缺陷及免疫治療策略的研究，免疫治療呈現(xiàn)出有希望的前景。CD4+CD25+Tregs是具有免疫負調節(jié)作用的重要T細胞亞群，目前在MM中的作用越來越受到關注。雖然MM患者體內Tregs升高的原因及其發(fā)生免疫作用的機制還不十分清楚，但研究表明Tregs與MM病程進展、預后及免疫治療存在密切聯(lián)系，為MM治療提供了新的方向。

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