Btk抑制劑的研究進展

鄧 容，趙利枝

(魯南制藥集團股份有限公司，山東臨沂276005)

Btk(Bruton's tyrosine kinase)即布魯頓酪氨酸蛋白激酶，是非受體酪氨酸激酶Tec家族的成員。1952年美國醫(yī)生Ogden Bruton發(fā)現(xiàn)性聯(lián)無丙種球蛋白血癥，并命名為Bruton綜合癥。1993年de Weers等［1］發(fā)現(xiàn)并命名為Btk，在前B淋巴細胞過渡為后期B細胞過程中，Btk為細胞分化和增值所必需基因，且在B細胞淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病(ALL)和漿細胞瘤中均有表達。但是仍沒有關于靶向小分子抑制劑和相關藥理研究。直到2006年之后，研究者發(fā)現(xiàn)磷酸化激活Btk為B細胞受體(BCR)信號通路的關鍵組成部分，是靶向治療B細胞淋巴瘤等疾病的很好位點［2］。

Btk參與多種信號通路，與PI3K(磷脂酰肌醇－3－激酶)、G2蛋白雙受體等結合后發(fā)生激活，通過PLCg2(磷脂酶Cg2)、PKC－βⅠ(蛋白激酶C－βⅠ)等下游信號分子，參與對血管生成、細胞增殖和凋亡以及細胞運動的調節(jié)［3］。除此之外，Btk還參與到許多其他造血細胞信號途徑，例如，參與巨噬細胞中Toll樣受體和細胞因子受體介導的信號通路，參與肥大細胞中IgE受體的信號傳導等［4］。

近年來研究顯示，Btk信號通路是目前非霍奇金淋巴瘤(NHL)，特別是慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞淋巴瘤及自身免疫疾病臨床治療研究中的新熱點。本文將就Btk激酶抑制劑的分子作用機理及其臨床研究予以概述。

1 Btk激酶抑制劑的作用機理

除了T淋巴細胞和自然殺傷細胞之外，Btk是其他所有造血細胞類型中表達的關鍵信號酶。B細胞表面的BCR與其抗原結合，通過抗原誘導BCR聚集，激活下游的Lyn和Fyn等Src家族分子，激活的Src家族磷酸化在Tyr551和Tyr223位點的Btk。活化的Btk可通過進一步磷酸化PLCg2升高細胞內鈣離子濃度，MAPKs、NF－κB和AKT信號通路的激活等，可能刺激磷酸酶中這些位點的磷酸化作用，從而調控基因和細胞因子的表達，影響B(tài)細胞的存活、增殖和分化［5］。

Btk由PH結構域、TH結構域、SH3結構域、SH2結構域和SH1/TK結構域等5部分組成［6］，所有酪氨酸激酶中僅Btk含有PH結構域。Btk首次激活在SH1/TK結構區(qū)，進一步激活在SH3和SH2結構區(qū)，包括主要的自身磷酸化位點。PH結構區(qū)包括轉錄因子BAP－135/TFII－I的連接位點，抑制劑如PIN1、IBtk(Btk抑制劑)的抑制部分，調節(jié)Btk和PIP的相互作用。Btk和PIP3結合后轉移到細胞膜成為膜型，自我磷酸化，由Lyn和Syk激酶反式磷酸化而激活。臨近PH結構區(qū)的部分是TH結構區(qū)，為PKC－β連接位點。PKC－β能在Ser－180直接磷酸化TH結構區(qū)，使Btk回到胞質層。和PIN1、SH3BP5、CAV1及IBtk的相互作用也能下調Btk的激酶活性。通過PH區(qū)域、活化循環(huán)中的Y551、SH3區(qū)域的Y223自身磷酸化位點控制Btk，阻斷SH3區(qū)域可激活Btk。ATP連接位點和抑制片段在SH1/TK結構區(qū)［7］。

在X連鎖無丙種球蛋白血癥中，Btk突變會破壞Btk功能，致使患者體內缺乏抗體和成熟的外周B淋巴細胞。Btk在骨髓細胞功能中通過免疫復合體激活FcγR信號。在巨噬細胞中，Btk抑制能阻斷 FcγRIII誘導的 TNF－α、IL－1β和IL－6產物，通過NF－κB活化阻斷BCR依賴的B細胞增殖，這為Btk在自身免疫疾病和B細胞淋巴瘤的治療提供了有力證據(jù)［8］。成熟B細胞的淋巴增殖紊亂，如基底生長、存活、腫瘤進展等，可異常調節(jié)Btk活性。Btk的激活是CLL的必要條件，能使CLL小鼠模型中白血病增多。另外，改變BCR－Btk信號通路能改善DLBCL中活化B細胞樣亞型的細胞存活。結直腸癌、ALL、CML也和Btk的變化有關［7］。

2 已上市及臨床研究中的小分子Btk抑制劑

2.1 Ibrutinib Ibrutinib(依魯替尼，PCI 32765，商品名:Imbruvica)，由美國Pharmacyclics inc研發(fā)，于 2013年11月被FDA批準用于治療既往接受至少1次治療的套細胞淋巴瘤(MCL)，2014年2月又批準用于既往至少接受過一種藥物治療的CLL。Ibrutinib膠囊的規(guī)格為140 mg/粒，口服每天1次，每次560 mg。

在111例復發(fā)或難治的MCL患者中進行的Ⅱ期臨床試驗［9］，患者中位年齡68歲(40～84歲)，86%患者為中?；蚋呶?。自診斷來中位時間為42個月，中位既往治療次數(shù)為3(1～5次治療)。患者被分為兩組，每天1次，每次服用Ibrutinib膠囊560 mg，直至疾病進展或出現(xiàn)不能接受的毒性反應。主要終點即總應答率為68%，完全應答為21%，部分應答為47%。18個月的總生存率為58%。最常見的治療相關的不良反應為輕度到中度的腹瀉、疲勞和惡心。3級或以上血液學反應少見，包括中性粒細胞減少、血小板減少和貧血。Ⅰb－2臨床試驗［10］招募的 85例復發(fā)或難治的CLL/SLL患者中，大部分患者為高危患者，口服Ibrutinib每天1次，51例420 mg，34例840 mg。兩組的總應答率均為71%，420 mg組的部分應答率為20%，840 mg為15%。在26個月，可評估的無進展生存率為75%，總生存率為83%。

Burger JA等［11］在40例高危 CLL/SLL患者中，治療方案包括Ibrutinib 420 mg每天1次和利妥昔單抗每周1次，共4周;繼而以Ibrutinib每天1次+利妥昔單抗每月1次治療，共6個月;隨后行Ibrutinib單藥治療。40例患者中有38例持續(xù)接受治療，疾病無進展。20例患者在治療3個月時接受了早期療效評估，其中有17例達到了部分緩解，總體緩解率為85%。另有3例患者也達到了部分緩解，但伴有持久性淋巴細胞增多癥。與Ibrutinib單藥治療相比，加入利妥昔單抗后，患者的治療效果出現(xiàn)更快。Ibrutinib和ACY1215合用于MCL，能使細胞凋亡增加3倍［12］。Ⅰb/Ⅱ期臨床研究證實將Ibrutinib和奧法木單抗合用于既往治療的復發(fā)或難治CLL/SLL［13］。Ibrutinib+苯達莫司汀+利妥昔單抗用于復發(fā)或難治CLL/SLL的Ⅲ期試驗正在進行，預計2015年完成。

Ibrutinib治療華氏巨球蛋白血癥(WM)的一項Ⅱ期臨床已經完成，正進行Ⅲ期臨床試驗。

2.2 CC－292 CC－292(又名AVL－292)是美國Celgene公司研發(fā)的口服、高選擇性Btk抑制劑，用于治療B細胞相關的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括NHL、CLL及自身免疫和炎性疾病，包括RA和全身性紅斑狼瘡(SLE)?；瘜W名為N－(3－(5－氟－2－(4－(2－甲氧乙氧基)苯氨基)嘧啶－4－氨基)苯基)丙烯酰胺。研究證實CC－292結合的Btk的數(shù)量和CC－292在自身免疫疾病的膠原誘發(fā)性關節(jié)炎模型中的效能有關。健康志愿者的臨床試驗證實口服單劑量的CC－292 mg·kg－1能連續(xù)地和所有循環(huán)的Btk作用，PK分析表明CC－292能被快速吸收，30～120 min內達到血漿峰值濃度，中位消除半衰期為 1.9 h［14］。

BTK對破骨細胞(OC)功能也有影響。研究者證實雖然CC－292能增加OC分化，但也能通過抑制c－Src、Pyk2等所有與OC封閉帶形成有關的蛋白而抑制OC功能。Carfilzomib不能影響OC封閉帶的形成，但能明顯抑制OC分化。CC－292和Carfilzomib合用能抑制封閉帶的形成和OC分化，能更多的抑制OC功能。這些結果為治療MM和相關骨疾病提供治療依據(jù)［15］。

CC－292用于B細胞疾病的Ⅰb臨床研究結果顯示，在86例復發(fā)或難治性CLL和B－NHL患者中，耐受性好的劑量范圍為日劑量125～1 000 mg，即每天2次，每次375和500 mg［16］。最常見的治療相關的不良事件包括腹瀉、疲勞、頭痛和肌肉痙攣。在50例CLL患者中，17例(34%)部分應答。

2.3 ONO－4059 ONO－4059是日本Ono公司研發(fā)的用于治療B細胞淋巴瘤的Btk抑制劑，能與Btk共價結合，可逆性阻止BCR信號通路和B細胞增殖、激活。ONO－4059的IC50為2.2 nmol·L－1。在小鼠 CIA 模型中，ONO －4059通過抑制炎癥趨化因子和細胞因子，包括IL－6、IL－8和單核細胞的TNFα，同時軟骨破壞、骨損傷和血管翳形成減少，發(fā)揮治療作用。在細胞基礎分析中，ONO－4059分別在IC505.66 nmol·L－1和 22.4 nmol·L－1抑制單核細胞內 FcR 誘導的TNF和 IL－6形成。在10 nmol·L－1范圍內，ONO－4059阻止B細胞激活，而不影響T細胞激活［17］。

ONO－4059能抑制TMD－8細胞生長和Btk磷酸化，4 h IC50為 23.9 nmol·L－1，72 h IC50為 3.59 nmol·L－1。減少BTK磷酸化能下調 ERK磷酸化。10 nmol·L－1的 ONO－4059 分別和 25 nmol·L－1的多柔比星、500 nmol·L－1依托泊苷、1.5 nmol·L－1的長春新堿、1 000 nmol·L－1的地塞米松合用，細胞凋亡比率增加25、20、17和 29%［18］。數(shù)據(jù)顯示ONO－4059用于RA治療。ONO－4059用于復發(fā)或難治性CLL的Ⅰ期臨床正在進行。

2.4 HM71224 HM71224是韓國Hanmi公司研發(fā)的口服、小分子的Btk抑制劑，用于治療RA。2013年1月開始在62例健康成年男性志愿者中進行隨機、安慰劑對照的Ⅰ期臨床試驗，評價多個劑量的安全性、耐受性、藥動學、藥效學等［19］。

2.5 其他 除了前述藥物，還有一些進入臨床前研究的藥物，如羅氏公司的 RN －486［20］，美國 Gilead Sciences的 CGI－ 1746［21］，Genentech 和 CGI Pharmaceuticals 的 GDC －0834［22］等，體外研究均顯示出抗RA的作用。

3 結語

小分子Btk抑制劑通過作用于BCR信號通路，與Btk結合而抑制Btk自身磷酸化，阻止Btk的激活，從而阻斷細胞傳導并誘導細胞凋亡。Btk抑制劑選擇性強，毒副作用低，特別是Ibrutinib的上市，被FDA定為“突破性”新藥，其研究開發(fā)前景廣闊。隨著Btk抑制劑作用機制研究和臨床試驗的深入，會有更多的小分子Btk抑制劑逐步上市，對血液系統(tǒng)腫瘤和關節(jié)炎等疾病治療起到重要作用。

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