腦膠質(zhì)瘤治療及其動物模型的研究進展

仰湞臻，劉瑜潔，齊憲榮

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥劑學(xué)系，天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191）

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腦膠質(zhì)瘤治療及其動物模型的研究進展

仰湞臻，劉瑜潔，齊憲榮

（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥劑學(xué)系，天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191）

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)細胞腫瘤中最常見并且死亡率最高的腫瘤。盡管對其研究的重視程度日漸增加，膠質(zhì)瘤依然是現(xiàn)今最難治療的腫瘤。許多候選藥物在臨床前試驗有較好效果的藥物在臨床試驗后期失敗，提示動物模型的改進的必要性。隨著藥理學(xué)，藥劑學(xué)與分子生物學(xué)研究的進展，建立科學(xué)的、可重復(fù)性好的動物模型對于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，評價藥物療效與給藥方式有非常重要的意義。本文將目前對膠質(zhì)瘤的治療方法與動物模型的研究進行綜述。

腦膠質(zhì)瘤；治療策略；動物模型

專家簡介

齊憲榮，女，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師。研究方向為靶向藥物輸送系統(tǒng)、納米技術(shù)與生物技術(shù)的研究?，F(xiàn)任中國藥學(xué)會藥劑專業(yè)委員會委員，北京藥學(xué)會藥劑專業(yè)委員會副主任委員，國家外國專家管理局高端項目評審委員，參與國家自然科學(xué)基金評審，Biomaterials、IJP等多篇雜志的審稿工作。前期負責(zé)了國家863項目、國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金、教育部回國人員啟動基金等項目。作為學(xué)術(shù)骨干參加國家973計劃3項，參加國家重大新藥創(chuàng)制計劃的-新制劑與新釋藥系統(tǒng)技術(shù)平臺建設(shè)項目等。多次獲得省部級科研獎勵。目前國內(nèi)外已發(fā)表研究論文100余篇，其中以第一作者和通訊作者身份在國內(nèi)外發(fā)表論文90余篇，編寫教材與專著14部，獲發(fā)明專利3項。

腦膠質(zhì)瘤主要根據(jù)他們臨床現(xiàn)象和惡性程度分為四種等級（Ⅰ～Ⅳ）。除了等級Ⅰ的毛細胞型星形細胞瘤，其他所有的腦膠質(zhì)瘤都是惡性腫瘤。對于惡性腦膠質(zhì)瘤的治療方案主要包括手術(shù)切輔助放療和化療。雖然有很多的努力，但是病人的預(yù)后依然很差。放療和化療的耐受是治療的主要問題并且有很多機制，包括DNA損傷的分子耐受和凋亡，微環(huán)境弱化制劑毒性，以及血腦屏障的存在使得藥物不能夠有效達到腦部，體循環(huán)腫瘤治療由于不能達到腦部阻礙了其發(fā)揮療效。目前為止，膠質(zhì)瘤病人主要臨床試驗結(jié)果沒有有顯示臨床效果。

隨著研究的進展，新型的治療方法出現(xiàn)。從傳統(tǒng)的注射給藥，灌注，到藥物芯片，再到納米制劑靶向給藥。劑型的突破需要使用更加合理的動物模型進行評價。藥物的評價需要科學(xué)合理的膠質(zhì)瘤動物模型模擬人體的情況，闡明靶向治療以及聯(lián)合給藥治療對疾病進程的影響。

原發(fā)性腦腫瘤的動物模型在已經(jīng)發(fā)展了六十年，目前對于高侵襲性腦膠質(zhì)瘤模型有了明顯的進步。模型主要分為誘發(fā)性腦膠質(zhì)瘤模型，移植腦膠質(zhì)瘤模型和轉(zhuǎn)基因模型。雖然這些模型對于研究腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有顯著的貢獻，但是其對于更加有效的治療方法作用有限。

這篇綜述將對腦膠質(zhì)瘤的治療和動物模型種類進行介紹，重點介紹誘發(fā)膠質(zhì)瘤模型，各種人源膠質(zhì)瘤細胞的異種移植，包括干細胞樣細胞系和活體腫瘤球。目前沒有現(xiàn)存的動物模型能夠完全反應(yīng)出人膠質(zhì)瘤的特點。然而，不同的模型系統(tǒng)有助于研究腫瘤發(fā)展機制?？梢灶A(yù)見的是，對不同模型的綜合研究會提高對靶點的認知并且利于對新治療策略的進展。

1 腦膠質(zhì)瘤及其治療

1.1 腦膠質(zhì)瘤 腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）常見的發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%左右。根據(jù)腫瘤細胞的類型可分為星形細胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤和室管膜瘤［1］。而按世界衛(wèi)生組織（WHO）分級標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其非典型性、核分裂指數(shù)、內(nèi)皮細胞增殖和壞死程度分為4級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤（以毛細胞型星形細胞瘤和一般星形細胞瘤為主），患者平均存活時間為3～5年；Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤（以間型星形細胞瘤和多形性膠質(zhì)母細胞瘤GBM為主），患者平均存活時間為1～2年［2］。腦膠質(zhì)瘤多數(shù)呈膨脹性和浸潤性生長，具有“三高一低”即發(fā)病率高、病死率高和治愈率低的特點，該腫瘤手術(shù)不易切除，且預(yù)后不佳。臨床上患者主要表現(xiàn)為顱內(nèi)壓增高，如頭痛、嘔吐及視乳頭水腫等局限性神經(jīng)損害［3，4］。

1.2 治療方法 手術(shù)治療一直是腦膠質(zhì)瘤臨床治療的首選方案，對于低級別的膠質(zhì)瘤，最大限度的切除腫瘤能夠取得一定的治療效果。然而由于腦膠質(zhì)瘤的侵襲性，很難與正常腦組織區(qū)分，因此對于惡性膠質(zhì)瘤，手術(shù)過程中很難將腫瘤組織全部切除。為了殺傷腫瘤細胞還需要聯(lián)合放射治療、化療以及免疫治療、基因治療和光動力治療等。目前，臨床上常用的化療藥物主要有替莫唑胺［5］等。

由于血腦屏障限制了治療藥物從體循環(huán)達到大腦的靶細胞，使得很多體循環(huán)藥物的療效降低。所以，在給藥方式上，除了傳統(tǒng)的口服和靜脈給藥，一些新的給藥方法也在腦膠質(zhì)瘤的局部治療中表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。包括侵入性方法，藥物動力學(xué)方法以及生理學(xué)方法。

1.2.1 侵入性方法 侵入性方法包括：內(nèi)腦腦室灌注，即切除腫瘤后在空腔內(nèi)注入化療藥物或者對于不可以手術(shù)切除的腫瘤進行腫瘤內(nèi)注射［6，7］；加強對流傳送（Convenction enhanced delivery，CED），使用靜水壓通過導(dǎo)管輸送到腫瘤內(nèi)部或者腫瘤周圍，大幅度提高藥物分子在腫瘤部分的蓄積［8］并且可以避免溶液的回流［9］；腦內(nèi)植入含有藥物的生物可降解聚合物芯片，通過局部給藥遞送藥物到腦部腫瘤。目前使用最多的局部遞送的聚合物植入物是1，3－雙［2－氯乙基］－1－亞硝基脲（BCNU），也稱Gliadel芯片，在手術(shù)切除后植入切除的腫瘤空隙中［10］，其安全性和耐受性均較好；破壞血腦屏障，使用滲透壓的改變，磁共振誘導(dǎo)的超聲破壞［11，12］，使用緩激肽類似物等打開血腦屏障。這種短暫的破壞使得血腦屏障滲透性增加，引起藥物在腦部和腫瘤部位的蓄積。

1.2.2 藥物動力學(xué)方法 藥物動力學(xué)方法通過對藥物進行化學(xué)修飾，使得藥物成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向的活性分子，具有穿透血腦屏障（BBB）的能力。只有高疏水藥物（能形成少于8個氫鍵）和小分子藥物（少于400～600 Da）才可以擴過血腦屏障［13，14］。因此，一些研究人員嘗試改變藥物的親脂特性來提高他們跨過BBB的能力。

1.2.3 生理學(xué)方法 另外，生理學(xué)的方法是利用的腦部腫瘤組織代謝和生存的必需營養(yǎng)物質(zhì)的受體轉(zhuǎn)運體，以及腫瘤部位特定的結(jié)構(gòu)特點，通過配體與受體結(jié)合介導(dǎo)的內(nèi)吞跨過血腦屏障［15］。隨著納米材料和技術(shù)的發(fā)展，目前廣泛研究的能夠穿透血腦屏障的靶向納米載藥系統(tǒng)為腦部腫瘤的藥物治療帶來了新的希望，該載藥系統(tǒng)能將藥物有效地蓄積于腫瘤組織，從而提高療效，降低毒副作用。

文獻里有很多報道臨床前研究有效的新型治療方案，但是當(dāng)他們用于之后的臨床評價時，他們在臨床Ⅱ期或者Ⅲ期結(jié)果失敗。這些對于嚙齒類動物腫瘤成功而對于臨床的失敗可能由于以下幾點原因：①腫瘤模型沒有反應(yīng)出病人腫瘤的生物學(xué)特性；②動物和人類的藥代動力學(xué)不同；③腫瘤不能反正出人腫瘤的細胞異質(zhì)性［16］。這說明建立合理科學(xué)的膠質(zhì)瘤動物評價模型模擬膠質(zhì)瘤細胞在人體的病理狀態(tài)對制劑的評價具有重要的意義。

2 腦膠質(zhì)瘤動物模型的研究進展

為了更好的探索腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和生物學(xué)特性，研制有效的抗腦膠質(zhì)瘤藥物和靶向制劑，必須建立穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好的腦膠質(zhì)瘤動物模型。根據(jù)獲得腫瘤的來源，目前研究中應(yīng)用的膠質(zhì)瘤動物模型主要可分為誘發(fā)性腦膠質(zhì)瘤模型、移植腦膠質(zhì)瘤模型和轉(zhuǎn)基因腦膠質(zhì)瘤模型［17］。

2.1 誘發(fā)性腦膠質(zhì)瘤模型 誘發(fā)性腦膠質(zhì)瘤模型主要是使用誘導(dǎo)劑建立動物腦膠質(zhì)瘤模型，一般分為化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)和病毒誘發(fā)型。研究表明化學(xué)致瘤物質(zhì)如甲基亞硝基脲和乙基亞硝基脲在CNS中具有很高的腫瘤誘發(fā)率［18，19］。病毒誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的可能機制有兩種，其一是病毒通過將其基因組整合至宿主細胞基因組，導(dǎo)致宿主腫瘤相關(guān)基因的激活或抑癌基因的失活，其二是有些病毒本身就含有致癌基因，其編碼的蛋白可促使宿主細胞發(fā)生癌變。目前研究中應(yīng)用的可誘發(fā)腦膠質(zhì)瘤病毒有慢病毒載體（lentiviral vectors）［20］、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus pneumonia，RSV）［21］和多瘤病毒（John Cunningham virus，JCV）［22］等。應(yīng)用誘導(dǎo)劑在動物體內(nèi)誘發(fā)腦膠質(zhì)瘤可以在很大程度上模擬自然狀態(tài)下人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生，但該模型的生物特征不穩(wěn)定，其應(yīng)用也存在一定的局限性。

2.2 移植腦膠質(zhì)瘤模型 移植動物模型是目前應(yīng)用最多的腫瘤模型，常用構(gòu)建模型的動物有SD大鼠、F344大鼠、ICR小鼠、免疫缺陷動物如BALB／c裸鼠、SCID鼠等。根據(jù)腫瘤供體動物與受體動物之間種屬的差異性，移植動物模型可分為異種移植和同種移植模型。異種移植模型常用人膠質(zhì)瘤細胞系U87 MG［23］、U251 MG［24］、U373［25］和SHG－44［26］等，同種移植模型常用的細胞系有大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞系 C6［27］、9L［28］和小鼠膠質(zhì)瘤細胞系GL261［29］等。

移植動物模型根據(jù)接種部位也可分為異位移植和原位移植，早期多數(shù)報道的實驗研究普遍應(yīng)用的是腦膠質(zhì)瘤的異位移植模型［30～32］，該模型主要通過皮下注射膠質(zhì)瘤的細胞懸液，接種后觀察腫瘤的生長，用卡尺直接測量腫瘤體積變化。近年來，隨著立體定向以及嚴格的無菌操作等技術(shù)的不斷完善，臨床模擬性更好的膠質(zhì)瘤細胞系原位移植動物模型的應(yīng)用也逐漸增多［27，33，34］。該模型的建立是將動物進行麻醉后置于腦立體定位儀上，在無菌條件下，實施開顱手術(shù)將膠質(zhì)瘤細胞懸液注入動物腦內(nèi)。該方法建立的模型能更好的保留腦膠質(zhì)瘤的組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及細胞生物學(xué)特性，也可以通過磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（PET）等觀測動物腦內(nèi)腫瘤的生長情況，但造價比較昂貴，不便于臨床前研究。

膠質(zhì)瘤干細胞的成功分離和膠質(zhì)瘤病人衍生膠質(zhì)瘤干細胞使得移植模型利于對GBM的侵襲性的機制和適應(yīng)性進行研究［35］。干細胞培養(yǎng)方法已經(jīng)成功培養(yǎng)出很多腫瘤模型，包括小兒腦膠質(zhì)瘤［36］和GBM［37］。與傳統(tǒng)的在體外生長很久的膠質(zhì)瘤細胞相對比，膠質(zhì)瘤干細胞和病人衍生移植細胞模型表面小鼠腫瘤腦內(nèi)的侵襲性大部分基因表達模式與人類GBM相似。目前基本沒有分子生物學(xué)證據(jù)顯示貼壁培養(yǎng)比干細胞培養(yǎng)的神經(jīng)球更適合作為實驗?zāi)Ｐ停?8］。然而，貼壁培養(yǎng)模型可能更適合達到藥物高通量篩選的目的。

現(xiàn)今活體成像發(fā)光技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動物模型的研究，基于體內(nèi)生物發(fā)光和熒光成像技術(shù)建立的腦膠質(zhì)瘤熒光素酶（Luc）或綠色熒光蛋白（GFP）動物原位模型是一種新型的整體可視化動物模型［39～41］，可以對活體動物進行無創(chuàng)傷觀察，直接快速地監(jiān)測腫瘤的生長情況，并可對治療中腫瘤的變化進行實時、原位、活體觀測和評價，大大方便了腦瘤的臨床前研究，提高了評估的準(zhǔn)確性。另外綠色熒光蛋白的示蹤也方便了后期藥物治療效果相關(guān)評價指標(biāo)的考察。通過基因工程方法構(gòu)建Luc或GFP的真核表達載體并轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞中，進而利用穩(wěn)定表達Luc或GFP的腫瘤細胞接種至動物即可構(gòu)建整體可視化模型，可通過體外活體成像的方法對動物進行觀察。

2.3 轉(zhuǎn)基因模型 腫瘤的發(fā)生通常伴隨著癌基因和抑癌基因的突變或缺失，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生也不例外。研究表明在惡性膠質(zhì)瘤患者中通?？蓹z測到調(diào)控細胞周期和細胞程序性死亡的關(guān)鍵性腫瘤抑制基因Rb和p53的突變［42，43］以及第10染色體上磷酸酶基因PTEN的缺失［44］等，隨著人們在基因水平對膠質(zhì)瘤發(fā)生機制的認識逐步加深，以及近年來轉(zhuǎn)基因和基因剔除技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因膠質(zhì)瘤模型應(yīng)運而生。小鼠是最主要的轉(zhuǎn)基因模式動物，這些轉(zhuǎn)基因小鼠通過不同癌基因和抑癌基因的組合，實現(xiàn)腫瘤基因在小鼠中的過表達和抑癌基因的滅活，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生。另外也可以通過病毒載體介導(dǎo)［20，45］，將外源基因有效地整合到靶細胞基因組內(nèi)建立模型。該模型可在分子水平和細胞水平對動物的遺傳物質(zhì)進行改變，模擬出臨床上各類因素引起的基因變異而導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤，在病因?qū)W上更接近于腦膠質(zhì)瘤的自然發(fā)生過程，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療提供了良好的研究材料。

3 總結(jié)與展望

雖然有一些有效的藥物在臨床使用，但是他們大部分都難以通過BBB。一些局部和系統(tǒng)的靶向制劑提供了一些新型的給藥方法，使得藥物能夠在腫瘤部位蓄積。目前為止，還沒有一種動物模型可以完全的復(fù)制人類膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展使得藥物得到客觀嚴謹?shù)脑u價。異種接種包括化學(xué)誘導(dǎo)和血清培養(yǎng)的普通膠質(zhì)瘤細胞系在很大程度上都不能反應(yīng)人類膠質(zhì)瘤的基因情況，但是神經(jīng)球培養(yǎng)和活體腫瘤球接種以及基因工程模型可以復(fù)制人膠質(zhì)瘤的侵襲生長的特點。在未來的研究中，需要更好的和更完善的膠質(zhì)瘤模型來為治療策略的評價，以提供更好的模型基礎(chǔ)。

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Advances in glioma therapy and its animalmodels

YANG Zhen-zhen，LIU Yu-jie，QIXian-rong
（State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，Department of Pharmaceutics School of Pharmaceutical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China）

Glioma is themost common and deadly tumor in primary CNS tumors.Despite an increasing emphasis on developing new therapies formalignant gliomas，they are still among themost intractable tumors nowadays.Numerous candidate drugs fail at late stages in their clinical trials，after showing promising preclinical results，which prompt the essential of improving animalmodels for evaluation.With the development of pharmacology，pharmaceutics and molecular biology，new approaches need more scientific，repeatable animal models for understanding the pathogenesis of glioma and the evaluation of drug efficacy.This review presented recent development in methods of treating glioma and animalmodeling of glioma.

Glioma；Treatment strategy；Animalmodel

R739.41

A

2095－5375（2014）10－0559－005

國家基礎(chǔ)研究計劃（No.2013CB932501）；國家自然科學(xué)基金（No.81273454）；北京市自然科學(xué)基金（No.7132113）；教育部博士點基金（20130001110055）資助項目