基于全基因組克隆分析乙型肝炎病毒變異株的結(jié)構(gòu)和功能

付亞輝(綜述)，劉洪波(審校)

(1.大悟縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 大悟 432800; 2. 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001)

全球約有3.5億乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者，其中25%的感染者將發(fā)展成為肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。乙型肝炎疫苗的接種使中國(guó)人群的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)攜帶率從10%降到7.18%[2]，但仍然有近1.2億HBsAg攜帶者，他們存在發(fā)展為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化和HCC的風(fēng)險(xiǎn)。

HBV基因組為帶有單鏈缺口的雙鏈DNA，含有4個(gè)開(kāi)放讀框，分別編碼包膜蛋白、核心蛋白、多聚酶蛋白和X蛋白。病毒通過(guò)RNA中間體進(jìn)行復(fù)制。宿主的免疫反應(yīng)缺陷被認(rèn)為是引起HBV持續(xù)感染和HCC的主要原因[3]。HBV毒株對(duì)于乙型肝炎的臨床轉(zhuǎn)歸以及流行病學(xué)意義也有一定的作用。HBV不能在傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中繁殖，且HBV只能感染黑猩猩和人類(lèi)，因而很難研究來(lái)自患者和無(wú)癥狀攜帶者(asymptomatic carriers，ASC)HBV株的生物學(xué)功能。自Günther等[4]將來(lái)自于患者的HBV株的全長(zhǎng)基因組克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞并成功進(jìn)行體外培養(yǎng)后，以含1.2～1.3拷貝HBV基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)已被廣泛用于HBV變異株生物學(xué)特征的研究。該綜述基于該方法對(duì)不同來(lái)源的HBV變異株的結(jié)構(gòu)和功能屬性進(jìn)行總結(jié)。

1 來(lái)自乙型肝炎疫苗接種失敗者HBV株的研究

HBsAg是乙型肝炎疫苗的唯一組分，在暴露前接種具有預(yù)防作用，母嬰傳播暴露后接種也具有免疫保護(hù)作用。HBsAg中124～147位密碼子被認(rèn)為是S蛋白的中和表位(即a決定簇)，其突變可導(dǎo)致與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合效率降低，從而產(chǎn)生免疫逃逸，使突變株在人群中傳播[5-6]。因此，在世界范圍內(nèi)對(duì)常見(jiàn)突變體的監(jiān)測(cè)可作為預(yù)測(cè)現(xiàn)行乙型肝炎疫苗預(yù)防效率的一個(gè)重要手段，監(jiān)測(cè)結(jié)果也可為新一代乙型肝炎疫苗的研發(fā)提供提示。

除了各種S突變體降低了與抗HBs的結(jié)合效率，129L突變體(540位核苷酸A→T)雖然具有正常的結(jié)合抗HBs的能力，但其降低了免疫原性[7]。以突變的a決定簇替代野生型a決定簇的1.2拷貝長(zhǎng)度的HBV重組質(zhì)粒來(lái)研究突變株抗原性和免疫原性間的分離。同野生型病毒相比，129L突變株表達(dá)的HBsAg對(duì)24種針對(duì)a決定簇的單抗中的大多數(shù)具有更高的結(jié)合效率，但以129L突變的DNA免疫小鼠所產(chǎn)生的抗HBs滴度顯著降低，認(rèn)為129L突變所致的免疫原性降低與谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼岷笫杷栽黾佑嘘P(guān)。相比起來(lái)，從谷氨酸到組氨酸轉(zhuǎn)變的突變株129H并未顯示出這種獨(dú)特的生物學(xué)特征[8]。既然129L突變株不能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，那么129L突變株感染可能導(dǎo)致持續(xù)性感染。

2 來(lái)自急重型乙型肝炎患者HBV突變株的研究

盡管很少發(fā)生急重型乙型肝炎(fulminant hepatitis B，F(xiàn)HB)，但在HBV呈地方性流行的地區(qū)，F(xiàn)HB的高致死率已成為一個(gè)重要問(wèn)題。HBV感染的重癥化過(guò)程通常被歸因于異常的宿主反應(yīng)[3]，但越來(lái)越多的證據(jù)顯示，HBV某些基因型和特定的變異株與FHB的發(fā)病密切相關(guān)，在日本、中國(guó)以及印度的FHB患者中常見(jiàn)的HBV為B1、C2和D1亞型，而且來(lái)自不同地區(qū)，分屬不同基因亞型的HBV變異株可能存在相同的突變，如A1762T/G1764A基本核心啟動(dòng)子(basal core promoter，BCP)突變和G1896A前C基因終止密碼子突變等[9-12]。Hayashi等[13]認(rèn)為，B4/Ba亞型的BCP/前核突變體可能與FHB的進(jìn)展相關(guān)。Wu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自重型乙型肝炎和其他患者的毒株基因組的多個(gè)突變的突變頻率存在著顯著差異，認(rèn)為這種高頻突變或復(fù)雜突變的累積和持續(xù)與HBV感染的進(jìn)展及疾病惡化有關(guān)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，核心蛋白[9,11]、多聚酶[9]和前Bagaglio[14]等其他區(qū)域的變異株也與FHB的發(fā)生相關(guān)。

變異株相對(duì)于野生株有更高的復(fù)制效率，其被認(rèn)為是發(fā)展為FHB的重要原因[10,15]。Inoue等[15]在對(duì)一起重型乙型肝炎暴發(fā)的病例監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，1例死亡患者的HBV DNA水平高達(dá)1.1×1011拷貝/mL，且存在前C基因A1896突變、BCP區(qū)T1762/A1764雙突變等，因此認(rèn)為重癥感染的發(fā)展與快速?gòu)?fù)制的HBV突變株可能存在關(guān)聯(lián)。Sugauchi等[10]將來(lái)自重型乙型肝炎患者的Bj亞型前C啟動(dòng)子A1896突變克隆與來(lái)自新發(fā)乙型肝炎患者的Bj亞型和C亞型野生型克隆轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，以DNA印跡檢測(cè)復(fù)制子發(fā)現(xiàn)，突變克隆單鏈帶的密度顯著高于后兩者，認(rèn)為A1896突變使Bj亞型復(fù)制能力提高是導(dǎo)致FHB的可能原因。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HB與CHB患者HBV的基因型及基因組變異的分布相似[16]。因此，對(duì)于高復(fù)制能力和某些特定變異株是導(dǎo)致FHB的重要原因仍存在爭(zhēng)議。對(duì)于FHB的發(fā)生是否可能存在其他致病因素？以不同復(fù)制效率的HBV分離株DNA免疫小鼠，結(jié)果顯示，F(xiàn)HB分離株免疫組與ASC分離株免疫組之間的抗HBc水平相似；前者的抗HBs更高，高水平的抗HBs滴度不僅存在于FHB的高復(fù)制毒株，也存在于FHB的低復(fù)制毒株；FHB組與ASC組的HBV分離株免疫鼠脾細(xì)胞，并經(jīng)HBsAg誘導(dǎo)后產(chǎn)生的干擾素γ水平也無(wú)顯著差異。結(jié)果提示，F(xiàn)HB的發(fā)生可能是病毒株的生物學(xué)特征與宿主免疫反應(yīng)的共同結(jié)果[7]。

3 來(lái)自HCC患者全長(zhǎng)HBV基因組的研究

HBV的慢性感染是HCC最重要的危險(xiǎn)因素，某些特定基因型(如C基因型)或基因突變(特別是前C基因突變和BCP區(qū)突變)預(yù)示有更高的惡化風(fēng)險(xiǎn)[17]。通過(guò)全長(zhǎng)HBV基因組分析可探究HCC患者與非HCC患者的HBV分離株是否存在核苷酸序列差異；通過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染可揭示這些特定HBV分離株是否存在功能上的差異。

Takahashi等[18]報(bào)道，40例日本HCC患者血清中HBV分離株大多為C基因型，并存在BCP 和1762T/1764A的雙突變。其他多個(gè)國(guó)家或地區(qū)的橫向病例對(duì)照或隊(duì)列隨訪研究發(fā)現(xiàn)，T1762/A1764雙突變是CHB發(fā)展為HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19-21]。然而，F(xiàn)an等[22]在比較38例CHB和34例HCC患者的HBV基因型和X區(qū)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩組患者的T1762/A1764雙突變并無(wú)顯著差異，C基因型和更高病毒負(fù)荷有更高的T1762/A1764雙突變發(fā)生率。該研究采用橫斷面研究，且樣本量相對(duì)較小，未排除或校正如基因型等混雜因素，因此并不能完全否定BCP雙突變?cè)贖CC發(fā)展中的作用。HBV的高效復(fù)制可增加病毒變異的概率，HBV DNA的高水平也預(yù)示著HCC的高風(fēng)險(xiǎn)[23]。變異也可以影響病毒載量，HBV突變和持續(xù)復(fù)制可能是HCC發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其可通過(guò)相互影響大大提高患HCC的風(fēng)險(xiǎn)。Lin等[24]研究1例患者從ASC發(fā)展為HCC 4年間11個(gè)HBV分離株的全長(zhǎng)基因組發(fā)現(xiàn)，發(fā)展為HCC前后的所有分離株并無(wú)單一共同突變；通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，HCC后的分離株比HCC前的分離株有更強(qiáng)的復(fù)制能力。分子流行病學(xué)研究比較了中國(guó)和塞內(nèi)加爾的ASC的HBV DNA持續(xù)時(shí)間發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的ASC在感染30年后HBV DNA仍然存在，而塞內(nèi)加爾的ASC在感染30年后其HBeAg轉(zhuǎn)為陰性；而相比塞內(nèi)加爾，中國(guó)的HBV慢性感染者有更高的HCC發(fā)生率[25]。另一方面，干擾素治療可以降低HBV相關(guān)肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)也反證了這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即HBV復(fù)制能力可能同HCC的進(jìn)展相關(guān)[26]。復(fù)制能力更高的變異體顯然在面對(duì)藥物或宿主免疫攻擊時(shí)有著更高的突變發(fā)生率，而經(jīng)過(guò)選擇的突變逃逸株其復(fù)制能力的提高可能刺激機(jī)體更強(qiáng)的免疫病理反應(yīng)。

為了探討HBV復(fù)制循環(huán)中產(chǎn)生的剪接缺陷型基因組的功能，將來(lái)自HCC患者的HBV雙剪接變異體與對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)基因組共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該剪接體在HBV X表達(dá)框完好的情況下可增強(qiáng)全長(zhǎng)病毒的復(fù)制能力[27]。Kaur等[28]在分析HCC不同階段肝組織標(biāo)本中HBV的甲基化水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，HCC和肝硬化患者HBV基因組甲基化水平較陰性CHB患者組織中更高，在體外以HBV感染肝細(xì)胞也獲得了相似的甲基化模式。該研究提示，HBV基因組的超甲基化與組織惡化過(guò)程高度相關(guān)。對(duì)HBV基因組結(jié)構(gòu)以及分離株的功能性分析有助于了解HBV和HCC之間的相關(guān)性，但是對(duì)這些變化，如HBV基因組甲基化的生物學(xué)本義及其在HCC中的作用仍需進(jìn)一步的研究。

4 HBV耐藥突變株的研究

長(zhǎng)期的核苷類(lèi)似物治療常導(dǎo)致HBV耐藥株的出現(xiàn)，使治療失敗[3]。將HBV全長(zhǎng)基因組克隆后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，可以監(jiān)測(cè)分離株的藥物抵抗性或?qū)π滤幬锏拿舾行訹29]，也可研究耐藥突變體的功能性變化。Warner等[30]培養(yǎng)阿德福韋耐藥突變體(rtA181T/sW172)時(shí)發(fā)現(xiàn)，突變體不僅本身存在分泌缺陷，而且對(duì)野生型HBV病毒體的分泌有負(fù)作用；復(fù)制效率降低的阿德福韋耐藥突變體再發(fā)生前C或BCP區(qū)突變后，盡管HBeAg未能表達(dá)，但其復(fù)制能力可恢復(fù)到野生型水平[31]。因此，僅依據(jù)病毒載量判斷藥物治療是否失敗可能導(dǎo)致錯(cuò)誤判斷。

5 結(jié) 語(yǔ)

將來(lái)自于不同患者的HBV全長(zhǎng)基因組和剪接變異體克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行研究，可揭示不同HBV分離株變異所導(dǎo)致的復(fù)制能力、病毒蛋白的表達(dá)及屬性變化；結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究，可以進(jìn)一步證實(shí)HBV分離株的的進(jìn)化所導(dǎo)致的免疫性和致病性改變。因此，利用HBV全基因組克隆的體外培養(yǎng)方法，對(duì)HBV的臨床分離株進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，可為病毒因素在HBV相關(guān)性疾病的致病機(jī)制中所扮演角色的最終揭開(kāi)提供重要線索。

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