MicroRNA-33在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展

鄢夢(mèng)竹(綜述)，李書(shū)國(guó)(審校)

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科，湖北 宜昌 443002)

近年來(lái)，微RNA(microRNA，miRNA)倍受關(guān)注。自1993年在線蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物、植物以及病毒體內(nèi)存在大量的miRNA[1-2]。研究顯示，miRNA在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，尤其在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中起重要的作用[1]。研究表明，參與AS脂質(zhì)代謝的miRNA,包括miR-122、miR-370、miR-378/378*、miR-335、miR-27、miR-125a-5p和miR-33等[3]。該文就近年來(lái)報(bào)道的miR-33在AS發(fā)生和發(fā)展中對(duì)膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和脂肪酸代謝的影響及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，期望推動(dòng)miRNA在脂質(zhì)代謝紊亂方面的機(jī)制研究，能夠?qū)S的治療有一定的幫助。

1 miRNA的形成及作用機(jī)制

miRNA是一組內(nèi)源性的、高度保守的、大小約為22個(gè)堿基的非編碼RNA分子，參與體內(nèi)多種生物過(guò)程。其通過(guò)與靶基因mRNA的3′-非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平直接降解靶標(biāo)mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯。

1.1miRNA的形成 miRNA基因最初由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成具有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′polyA的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)，接著在細(xì)胞核中經(jīng)聚合酶ⅢDrosha和DGCR8組成的蛋白復(fù)合體作用，加工處理成大小為70～100 nt、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的次級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pre-miRNA)。然后pre-miRNA經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，由核酸酶Dicer切割，形成長(zhǎng)約22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后翻譯水平的調(diào)節(jié)作用[4-5]。

1.2miRNA的作用機(jī)制 miRNA與其靶基因mRNA的作用機(jī)制有兩種：當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的 3′UTR端不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，其在蛋白質(zhì)水平抑制目的基因的表達(dá)，阻遏翻譯但不影響mRNA的穩(wěn)定性；而當(dāng)miRNA與某段目的基因序列完全配對(duì)時(shí)，主要引起目的基因斷裂，最終在mRNA水平導(dǎo)致基因沉默[4]。

2 miR-33在AS中的研究

膽固醇和脂肪酸參與AS的發(fā)生、發(fā)展已經(jīng)得到公認(rèn)[6-8]。miR-33被證明在轉(zhuǎn)錄后水平抑制參與細(xì)胞膽固醇流出和HDL代謝基因，如腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter，ABC)A1、ABCG1、C型1類尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein，NPC1)，以及脂肪酸氧化基因，如肉堿O-辛基轉(zhuǎn)移酶(carnitine O-octanoyltransferase，CROT)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A)、羥烷基輔酶A 脫氫酶B/3-酮乙基-輔酶A硫解酶/烯酰輔酶A水合酶β亞單位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzy-me A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase β-subunit，HADHB)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等的表達(dá)[7,9]。因此，可以通過(guò)抑制miR-33的表達(dá)來(lái)解除其對(duì)以上基因的抑制，達(dá)到防止AS發(fā)生及促進(jìn)其轉(zhuǎn)歸的目的。

2.1miR-33調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇平衡 膽固醇是細(xì)胞膜的基本組成成分，在細(xì)胞的生物學(xué)功能方面起著重要作用。血漿膽固醇過(guò)剩導(dǎo)致其在動(dòng)脈壁聚集，從而引起AS的發(fā)生、發(fā)展[7,10]。如果能有效地調(diào)節(jié)膽固醇合成、攝取以及排除，將對(duì)治療AS非常有利。目前已知調(diào)控體內(nèi)膽固醇平衡的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子包括膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)和肝X受體。其中SREBP通過(guò)結(jié)合到增強(qiáng)子區(qū)域來(lái)活化參與膽固醇和脂肪酸生物合成及攝取基因的轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生三酰甘油和磷脂，SREBP主要有三種亞型：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2[8]。除了SREBP，肝X受體也參與體內(nèi)膽固醇和脂肪酸的調(diào)控。當(dāng)膽固醇水平升高時(shí)，肝X受體發(fā)生活化，誘導(dǎo)參與膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄蛋白的表達(dá)，參與該過(guò)程的因子包括ABCA1、ABCG1、ABCG5/G8和載脂蛋白E[7]。

最近研究表明，新發(fā)現(xiàn)的miR-33也參與體內(nèi)膽固醇平衡的調(diào)節(jié)[4]。通過(guò)與其宿主基因SREBP一起調(diào)節(jié)膽固醇/脂質(zhì)平衡[11-14]。在人體中存在兩種miR-33基因：miR-33b位于第17號(hào)染色體SREBP-1基因的17號(hào)內(nèi)含子區(qū)域，其宿主基因可選擇性調(diào)控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a位于第22號(hào)染色體SREBP-2基因的16號(hào)內(nèi)含子區(qū)域，其宿主基因控制著細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成和攝取；然而，在小鼠體內(nèi)只有miR-33a基因的表達(dá)位于SREBP-2基因的15號(hào)內(nèi)含子區(qū)域[14-15]。鑒于miR-33b序列只在大型哺乳動(dòng)物中表達(dá)，因此強(qiáng)調(diào)了miR-33a在種屬間進(jìn)化的高度保守性[1,8,16]。雖然miR-33a/b成熟形式只相差2個(gè)核苷酸，但它們與靶基因mRNA 3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn),即“種子序列”相同,因此有可能抑制相同基因的表達(dá)[13,17-18]。在膽固醇平衡的調(diào)節(jié)中，miR-33通過(guò)靶向ABCA1、ABCG1和NPC1發(fā)揮作用[8,11,19]。脊椎動(dòng)物中作用最突出的是ABCA1，它是HDL的生物合成和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)控者[14,16]。

在肝臟，ABCA1可以使額外的膽固醇從細(xì)胞流出到載脂蛋白A-I形成初生型HDL；在外周組織特別是AS損傷處的巨噬細(xì)胞中，ABCA1又介導(dǎo)胞內(nèi)膽固醇流出到初生型HDL，再傳遞到肝臟分解成膽汁酸來(lái)代謝,這個(gè)過(guò)程被稱為“膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)”，其在體內(nèi)膽固醇的平衡中發(fā)揮著重要作用，也是重要的抗AS機(jī)制。在各種細(xì)胞類型中，尤其是肝細(xì)胞，miR-33過(guò)表達(dá)可下調(diào)ABCA1蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少膽固醇流向載脂蛋白A1和初生型HDL的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制RCT[5,12]；相反，抑制miR-33的表達(dá)可增加肝臟ABCA1蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而增強(qiáng)RCT。這一結(jié)果表明，抑制miR-33的表達(dá)可阻止AS的發(fā)生、發(fā)展[16,20]。有研究顯示，來(lái)源于miR-33不足的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞ABCA1水平顯著增加，具有更多載脂蛋白A-I依賴的膽固醇流出，肝臟ABCA1蛋白水平也更高，表明miR-33在調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)和膽固醇流出中起著極其重要的作用，因此可以通過(guò)適當(dāng)下調(diào)miR-33水平來(lái)達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的[21]。也有研究報(bào)道，在小鼠體內(nèi)通過(guò)反義寡核苷酸技術(shù)、病毒傳遞性發(fā)夾抑制劑沉默miR-33a，或有針對(duì)性地剔除miR-33a,可以增加肝臟ABCA1水平和循環(huán)HDL水平，其最高可達(dá)40%[12-13,22]。另一份報(bào)道顯示，使用慢病毒過(guò)表達(dá)反義miR-33，6 d后肝臟ABCA1蛋白水平增加50%，伴隨血漿HDL水平增加25%[21]。Marquart等[23]也表示，體內(nèi)注入反義miR-33寡核苷酸可導(dǎo)致ABCA1表達(dá)和HDL水平大幅提升。miR-33靶向ABCA1與SREBP協(xié)同調(diào)控膽固醇平衡，使miR-33有望成為治療并改善AS的新療法。

除了ABCA1，研究人員還發(fā)現(xiàn)另外兩種參與膽固醇動(dòng)員的miR-33靶基因：ABCG1和NPC1，ABCG1促進(jìn)膽固醇外排到高密度脂蛋白，NPC1將膽固醇從溶酶體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)其他部位，以便進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)運(yùn)[11-12]。小鼠ABCG1基因的3′UTR包含兩個(gè)miR-33結(jié)合位點(diǎn)，而人類基因3′UTR不存在這些位點(diǎn)，在小鼠巨噬細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-33時(shí)可抑制ABCG1蛋白的表達(dá)，而在人類卻不出現(xiàn)類似的情況，表明該基因由miR-33的種屬特異性調(diào)控[12,19]。Rayner等[13]報(bào)道，在抗miR-33 4周的低密度脂蛋白受體基因剔除(LDLR-/-)小鼠肝臟中ABCG1的蛋白水平增加。然而其他研究表明，小鼠體內(nèi)的miR-33的消耗并沒(méi)有改變肝臟中ABCG1蛋白的水平，表明miR-33調(diào)節(jié)ABCG1可能取決于動(dòng)物模型的遺傳背景[11]。人類NPC1的3′UTR包含兩個(gè)miR-33結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致NPC1蛋白表達(dá)被人類巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中的miR-33抑制。NPC1還能夠與ABCA1協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流向載脂蛋白A1，表明miR-33對(duì)人的胞內(nèi)膽固醇外排功能進(jìn)行了雙重抑制[12]。小鼠NPC1基因的3′UTR只有1個(gè)miR-33結(jié)合位點(diǎn)，但是不會(huì)被miR-33抑制?？偠灾琺iR-33通過(guò)特異性靶向ABCA1、ABCG1和NPC1 3′UTR來(lái)調(diào)控體內(nèi)膽固醇平衡，而其他不含miR-33靶點(diǎn)的脂質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)并沒(méi)有明顯改變。在其他包含假定miR-33結(jié)合位點(diǎn)的基因，如3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白基因也只是輕度下調(diào)，而在mRNA和蛋白表達(dá)水平并沒(méi)有改變[19]。

miR-33在膽固醇調(diào)節(jié)中起到了不可或缺的作用，其通過(guò)胞內(nèi)膽固醇出發(fā)的負(fù)反饋環(huán)來(lái)發(fā)揮功能，當(dāng)膽固醇含量不足時(shí)，miR-33和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子2同時(shí)轉(zhuǎn)錄共同調(diào)節(jié)膽固醇平衡，通過(guò)同時(shí)開(kāi)始膽固醇攝取和合成路徑，抑制膽固醇流出；而當(dāng)胞內(nèi)膽固醇過(guò)量時(shí)，miR-33又可以通過(guò)ABCA1途徑促進(jìn)膽固醇流出。所以，體內(nèi)miR-33的異常表達(dá)可引起一系列代謝性疾病，尤其是AS。

2.2miR-33調(diào)節(jié)HDL-C的生物合成 血漿HDL-C水平與心血管疾病有很強(qiáng)的負(fù)性關(guān)系，因此，升高HDL-C水平的治療成為研究的焦點(diǎn)。通過(guò)Framingham心臟研究表明，每增加1%循環(huán)HDL-C，發(fā)展為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病危險(xiǎn)可減少2%[24]。ABCA1除了參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，還參與肝臟HDL-C的形成，提示miR-33對(duì)血漿HDL-C水平的調(diào)控具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miR-33通過(guò)抑制ABCA1的表達(dá)，可以降低血漿HDL水平，拮抗內(nèi)源性miR-33表達(dá)后，小鼠血漿HDL水平明顯升高，同時(shí)減少了斑塊大小、脂質(zhì)成分以及炎癥基因的表達(dá)，增加了斑塊的穩(wěn)定性[16,22]。Rayner等[24]在LDLR-/-的小鼠AS模型進(jìn)行為期4周的抗miRNA寡核苷酸治療，結(jié)果顯示，HDL-C水平有效升高，斑塊巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)成分減少35%，膠原成分增加2倍，提高了病變的改造和斑塊的穩(wěn)定性，促進(jìn)AS斑塊轉(zhuǎn)歸。Marquart等[25]報(bào)道，miR-33的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引使HDL-C水平減少了29%，相反，在miR-33a-/-小鼠中，巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞ABCA1的表達(dá)水平均升高，并增加了基線HDL水平。Najafi-Shoushtari等[14]在高脂飲食的小鼠模型中，利用鎖定miR-33a的特定核苷酸處理動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)血漿HDL-C水平上調(diào)約35%。另外，除了靶向肝臟，Rayner等[24]研究表明，2′氟代/甲氧乙基-修飾的硫代硫酸主鏈反義寡核苷酸注射可以滲透AS斑塊到達(dá)病變的巨噬細(xì)胞中，從而上調(diào)ABCA1的表達(dá)，增強(qiáng)膽固醇從泡沫細(xì)胞排除。因此，抗miR-33功能不僅升高HDL和促進(jìn)RCT，也直接靶向調(diào)節(jié)斑塊中的巨噬細(xì)胞，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞膽固醇流出路徑來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)RCT，在巨噬細(xì)胞中抑制miR-33可能也會(huì)有利于阻止斑塊破裂?？筸iR-33治療升高血漿HDL的結(jié)果也在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物中被證實(shí)[19]。

有研究顯示，在LDLR-/-的小鼠體內(nèi)注射抗miR-33寡核苷酸(每周1次，共14周)，血漿樣本分析顯示，在處理最初2周內(nèi)HDL-C升高，但沒(méi)有持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)┪瞇17]。在抗miR-33處理的小鼠中，與對(duì)照組相比循環(huán)三酰甘油的水平顯著增加，最后檢查發(fā)現(xiàn)斑塊的大小和成分并沒(méi)有重大改變，表明在LDLR-/-小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期沉默miR-33不能維持血漿HDL-C水平的升高，即不能阻止AS的發(fā)生、進(jìn)展[25]。

抗miR-33可通過(guò)反義抑制劑或剔除等方法來(lái)升高循環(huán)HDL-C水平，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇的流出和RCT，這些均表明靶向反義寡核苷酸的miR-33可能作為減少AS的新型治療策略。

2.3miR-33的調(diào)節(jié)脂肪酸代謝 miRNA除了可以調(diào)節(jié)膽固醇的平衡和HDL-C的生物合成外，還可直接調(diào)節(jié)與脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)。miR-33減少參與脂肪酸氧化基因的表達(dá)，如CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα等；同時(shí)還增加參與脂肪酸合成基因的表達(dá)，如膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1、脂肪酸合成酶、ATP枸櫞酸鹽裂解酶和乙酰-輔酶A羧化酶等。CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα都含有功能性的miR-33a/b結(jié)合位點(diǎn)。CROT是一種過(guò)氧化物酶體的酶，催化短鏈脂肪酸向肉堿轉(zhuǎn)移，使它們可通過(guò)β-氧化降解，促進(jìn)脂肪酸從過(guò)氧化物酶體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)[11]。CPT1A是β-氧化的限速酶，是必需的乙酰輔酶A的耦合肉堿，使長(zhǎng)鏈脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體進(jìn)行β氧化。HADHB可催化線粒體對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化的最后三個(gè)步驟，而AMPKα刺激肝的脂肪酸氧化和生酮作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-33時(shí)，CPT1A和HADHB的表達(dá)水平降低，衰減脂肪酸β氧化，大大減少脂肪酸降解，導(dǎo)致中性脂質(zhì)的聚集；相反，內(nèi)源性抑制miR-33的表達(dá)可增加脂肪酸的降解[8,10]。Rayner等[13]研究表明，在用反義miR-33寡核苷酸處理的非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物中，血漿極低密度脂蛋白的水平顯著降低。這些研究均表明，抗miR-33的治療可能是一種很有前景的策略，以提高血漿HDL和降低極低密度脂蛋白三酰甘油的水平，從而達(dá)到治療高脂血癥和AS的目的。

3 展 望

miR-33通過(guò)參與脂質(zhì)代謝在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用?；谶@一點(diǎn)，可以通過(guò)抑制miR-33的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇反轉(zhuǎn)運(yùn)、增加循環(huán)HDL-C，使抗miR-33作為新型治療AS和心血管疾病的有效方式。因此，有效沉默miR-33和(或)他汀類藥物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)提高HDL和降低低密度脂蛋白的水平可能是治療AS的新策略。雖然miR-33可作為潛在的藥物治療靶向，但仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如單一的miR-33如何在體內(nèi)外嚴(yán)格調(diào)控多目標(biāo)基因的表達(dá)，共轉(zhuǎn)染不同的miRNA在單個(gè)靶基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生哪些影響；還存在哪些更多的miR-33靶點(diǎn)，其調(diào)控機(jī)制如何；拮抗miR-33是否對(duì)其他組織器官產(chǎn)生一些不利影響；有效合成的治療性miR-33能否被安全傳送到特定的靶組織，是否會(huì)產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，這些問(wèn)題都有待于進(jìn)一步的研究和不斷的探索。

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