擬南芥木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控研究

王玉琪，賀俊波，吳藹民

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新能源與新材料研究所，廣東廣州 510642)

木質(zhì)纖維素指任何纖維素和木質(zhì)素等作為基本要素積累形成的材料，是地球上最豐富的生物質(zhì)和可再生資源，近年來(lái)被開(kāi)發(fā)成重要的可更新的生物質(zhì)能源材料［1］.現(xiàn)階段，液體生物質(zhì)燃料原料開(kāi)發(fā)主要來(lái)源于糖、淀粉和油脂類(lèi).而從長(zhǎng)期的角度出發(fā)，生物質(zhì)能源原料應(yīng)該主要來(lái)源于木質(zhì)纖維素和藻類(lèi)油脂等［2-3］.雖然目前木質(zhì)纖維素可以通過(guò)水解和酶解等一系列手段使纖維素降解成葡萄糖，并最終降解轉(zhuǎn)化為乙醇，但其工藝較為復(fù)雜，成本較高［2-4］.而通過(guò)了解木質(zhì)纖維素形成的分子機(jī)理，特別是次生壁的形成機(jī)理，從而定向改變木質(zhì)纖維素材料的生物結(jié)構(gòu)和遺傳品質(zhì)，尤其是降低半纖維素和木質(zhì)素的成分，改變其結(jié)構(gòu)，可以簡(jiǎn)化工藝流程，降低多糖降解為單/寡糖的糖化成本，滿(mǎn)足提高生物質(zhì)能源產(chǎn)量的要求.這已成為全球能源植物基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)［2-6］.木質(zhì)纖維素的積累主要通過(guò)次生加厚生長(zhǎng)完成，它主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3部分組成［7］.其中，半纖維素在初生壁中以木葡聚糖(Xyloglucan)存在，但在闊葉樹(shù)的次生壁中木葡聚糖極少，主要以木聚糖(Xylan)形式存在［8］.木聚糖主要由β-(1，4)-D-Xyl(木糖基)為主鏈、葡萄糖醛酸和/或甲基化的葡萄糖醛酸為側(cè)鏈組成.另外，其還原末端由β-D-Xyl(木糖基)p-(1→3)-α-L-Rha(鼠李糖基)p-(1→2)-α-D-Gal(半乳糖基)p A-(1→ 4)-D-Xyl p構(gòu)成［9-10］.基于木聚糖的結(jié)構(gòu)，估計(jì)需要多個(gè)酶來(lái)參與木聚糖的主鏈的延長(zhǎng)、還原末端的合成和側(cè)鏈的修飾.在擬南芥 Arabidopsis thaliana中，已報(bào)道基因FRA8(Fragile fiber 8)、F8H(Fragile fiber 8 homolog)、IRX9(Irregular xylem 9)、IRX9-L(Irregular xylem 9-like)、IRX14、IRX14-L、IRX10 和 IRX10-L 可能參與木聚糖主鏈的延長(zhǎng)［10-15］.其中，F(xiàn)RA8、IRX9、IRX14 和IRX10是主效基因，而 F8H、IRX9-L、IRX14-L和IRX10-L是次效基因.最近的研究結(jié)果也證明了IRX9基因和IRX14基因共同作用能將寡糖聚合更長(zhǎng)［16］.另外，基因 GUX1(Glucuronic acid substitution of xylan 1)、GUX2和GUX3負(fù)責(zé)將葡萄糖醛酸(GlcA)加到木聚糖的側(cè)鏈上［17］.

目前，已報(bào)道有眾多轉(zhuǎn)錄因子參與次生細(xì)胞壁的加厚生長(zhǎng).研究表明SND1(Secondary wall-associated NAC domain protein 1，also called NST3)、NST1(NAC secondary wall thickening promoting factor 1)、NST2、VND6(Vascular-related NAC-domain 6)、VND7是調(diào)控植物次生細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［18-23］.SND1基因和NST1基因促進(jìn)纖維細(xì)胞次生壁的形成［20-22］，而 VND6、VND7 基因參與導(dǎo)管次生壁的形成［24］.研究表明NST1和NST2基因在調(diào)控花藥內(nèi)層細(xì)胞的次生壁加厚上存在功能冗余［20］.轉(zhuǎn)錄因子SND1、NST1、NST2、VND6 和 VND7 能夠調(diào)控 SND2、SND3、KNAT7(Knotted-like homeobox of Arabidopsis Thaliana 7)、MYB20(MYB domain protein 20)、MYB42、MYB43、MYB46、MYB52、MYB54、KMYB69、MYB85、MYB103等次生壁相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)［21-22，24］. 其 中 基 因 SND3、KNAT7、MYB46 和MYB103 是轉(zhuǎn)錄因子 SND1、NST1、NST2、VND6 和VND7的直接靶標(biāo)，顯性抑制基因 SND2、SND3、MYB52、MYB54、MYB85和MYB103顯著降低纖維細(xì)胞次生壁的厚度［24］.此外，研究表明IFL1基因參與調(diào)控?cái)M南芥束間纖維的分化［25］.

木質(zhì)素的生物合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控目前研究較為清楚.木質(zhì)素生物合成有關(guān)的12個(gè)酶中，10個(gè)酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中，在5'非翻譯區(qū)100 bp以?xún)?nèi)的序列上，至少有1個(gè)相對(duì)保守的AC元件，一些MYB類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子可以與AC元件結(jié)合［26-27］.然而，目前為止鮮見(jiàn)專(zhuān)門(mén)研究調(diào)控木聚糖合成的轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道.我們從 SND1、NST1、NST2、VND7、KNAT7、ERF72(Ethylene response factor 72)、IFL1、MYB20、MYB46、MYB52、MYB69、MYB85 和 MYB103 等次生壁相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子著手，分析這些轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控基因 FRA8、IRX9、IRX10、IRX14、F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的表達(dá).這一研究有助于弄清木聚糖的合成網(wǎng)絡(luò)，并且將為進(jìn)一步把木質(zhì)纖維素開(kāi)發(fā)成生物燃料打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

用于制備原生質(zhì)體的擬南芥植株為野生型，購(gòu)自美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心(The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)，在 22 ℃，光周期為光照13 h黑暗11 h，50 ～75 μE ·m–2· s–1的弱光條件下培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 效應(yīng)器和報(bào)告器的構(gòu)建 通過(guò)PCR反應(yīng)克隆轉(zhuǎn)錄因子基因 SND1、NST1、NST2、VND7、KNAT7、ERF72、IFL1、MYB20、MYB46、MYB52、MYB69、MYB85和MYB103的全長(zhǎng)DNA或cDNA，基因 FRA8、IRX9、IRX10、IRX14、F8H、IRX9-L、IRX10-L和 IRX14-L 的啟動(dòng)子序列，再通過(guò)BP重組反應(yīng)將這些序列接到入門(mén)載體pDONR207上，測(cè)序驗(yàn)證序列后通過(guò)LR重組反應(yīng)將轉(zhuǎn)錄因子的序列連接到終載體pUGW2上，將調(diào)控序列連接到終載體pUGW35上.

1.2.2 擬南芥原生質(zhì)體的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［28］介紹的方法制備擬南芥原生質(zhì)體.將弱光條件下種植的擬南芥的葉片剪成約1 mm寬的細(xì)絲，放入含有纖維素酶和離析酶的酶液中消化.然后用75μm的尼龍膜過(guò)濾酶液，收集濾液并洗滌.

1.2.3 轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體 用PEG4000-Ca2+溶液介導(dǎo)效應(yīng)器、報(bào)告器和內(nèi)參質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體.每個(gè)樣品用1×105個(gè)原生質(zhì)體.

1.2.4 測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶和海參熒光素酶的活性 用Dual-Luciferase reporter assay system試劑盒(Promega公司)在GloMaxTM20/20發(fā)光檢測(cè)儀(Promega公司)上分別測(cè)定樣品中螢火蟲(chóng)熒光素酶和海參熒光素酶的活性.

1.2.5 顯性抑制技術(shù) 將KNAT7基因的無(wú)終止密碼子的全長(zhǎng)DNA連接到載體pCAMBIA1304上，構(gòu)建pCAMBIA1304-p35S∷KNAT7-SRDX表達(dá)載體.通過(guò)農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens花序浸染法將pCAMBIA1304-p35S∷KNAT7-SRDX表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中.通過(guò)潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株.同時(shí)種植轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株，并在相同條件下培養(yǎng).

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.用t檢驗(yàn)法分析處理組與對(duì)照組是否有顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的克隆

先前的研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖合成酶關(guān)鍵基因主要在莖的維管組織(Vascular tissue)表達(dá)［14-15］，而已有研究表明轉(zhuǎn)錄因子 SND1、NST1、NST2、VND7、KNAT7、ERF72、IFL1、MYB20、 MYB46、MYB52、MYB69、MYB85和MYB103參與擬南芥次生壁導(dǎo)管的加厚生長(zhǎng)［24］.為了研究木聚糖合成酶關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們首先克隆這些已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子基因來(lái)分析它們是否對(duì)木聚糖合成酶關(guān)鍵基因有調(diào)控作用.按照已發(fā)表的基因序列，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)克隆這些轉(zhuǎn)錄因子基因(圖1a、1b)，連接到載體中并測(cè)序驗(yàn)證.同時(shí)克隆木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子序列(圖1c)，并連接到載體中測(cè)序驗(yàn)證.

圖1 部分轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of partial promoters’and transcription factors’PCR products

2.2 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因FRA8、IRX9、IRX10和IRX14的調(diào)控作用

將這些轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)序列連接到花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的下游，構(gòu)建成效應(yīng)器，再將木聚糖合成酶的主效基因 FRA8、IRX9、IRX10和IRX14的啟動(dòng)子分別連接到報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光素酶基因(Fire luciferase，F(xiàn)LUC)的上游，構(gòu)建報(bào)告器(圖2).克隆的 FRA8、IRX9、IRX10 和 IRX14 基因的啟動(dòng)子序列的范圍依次是-2305～+196、-2011～+34、-663～+162和-2702～+153.將效應(yīng)器、報(bào)告器和攜帶有位于CaMV35S下游的海參熒光素酶基因(Renilla Luciferase，RLUC)的內(nèi)參質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定FLUC蛋白和RLUC蛋白的活性.FLUC蛋白、RLUC蛋白的活性的比值代表FLUC報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量，以只轉(zhuǎn)染了報(bào)告器和內(nèi)參質(zhì)粒的擬南芥原生質(zhì)體中的FLUC報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量作為對(duì)照組(CK).

圖2 效應(yīng)器、報(bào)告器和內(nèi)參質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of effecter，reporter and internal reference plasmid

將克隆的所有次生生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，分別轉(zhuǎn)入上述的反式激活體系中，篩選FLUC報(bào)告基因的相對(duì)活性較高的處理組合，篩選出來(lái)的處理組合各設(shè)置3個(gè)重復(fù).試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子KNAT7、ERF72、MYB46、MYB103能促進(jìn) FRA8基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子 SND1、KNAT7、MYB46、MYB85能促進(jìn)IRX9基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子 SND1、NST2、VND7、MYB85能促進(jìn)IRX10基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子NST2、MYB46能促進(jìn)IRX14基因的表達(dá)(圖3).

圖3 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因FRA8、IRX9、IRX10和IRX14的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的激活作用Fig.3 The activation of the transcription factors to the reporter gene driven by the promoters of FRA8，IRX9，IRX10 and IRX14

2.3 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因 F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的調(diào)控作用

將木聚糖合成關(guān)鍵酶中的次效基因F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的啟動(dòng)子序列連接到FLUC報(bào)告基因的上游，構(gòu)建報(bào)告器.克隆的 F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的啟動(dòng)子序列的范圍依次是-2243～+259、-1212～ +220、-2277～ +237和-513～+28.將效應(yīng)器、報(bào)告器和內(nèi)參質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定FLUC蛋白和RLUC蛋白的活性.FLUC蛋白、RLUC蛋白活性的比值代表FLUC報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量，以只轉(zhuǎn)染了報(bào)告器和內(nèi)參質(zhì)粒的擬南芥原生質(zhì)體中的FLUC報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組.

將克隆的所有次生生長(zhǎng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，分別轉(zhuǎn)入上述的反式激活體系中，篩選FLUC蛋白相對(duì)活性較高的處理組合，篩選出來(lái)的處理組合各設(shè)置3個(gè)重復(fù).未篩選出能促進(jìn)IRX10-L基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子.瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄激活分析試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄因子SND1、NST2、MYB20、MYB46能促進(jìn)F8H基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子ERF72能促進(jìn)IRX9-L基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子VND7、KNAT7、ERF72、MYB46、MYB103 能促 進(jìn)IRX14-L基因的表達(dá)(圖4).

2.4 植物體內(nèi)顯性抑制KNAT7的表達(dá)

由于KNAT7轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著地激活基因FRA8、IRX9和IRX14-L的表達(dá)，因此用顯性抑制方法來(lái)進(jìn)一步探究KNAT7基因在植物體內(nèi)的功能.這一方法已經(jīng)被成功地用于研究與次生壁合成有關(guān)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子［18-22］.將無(wú)終止密碼子的KNAT7基因的全長(zhǎng)DNA序列連接到CaMV35S下游和顯性EAR抑制序列的上游，在擬南芥內(nèi)顯性抑制融合表達(dá).KNAT7基因顯性抑制的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比顯著變矮，發(fā)育不正常(圖5).

圖4 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因F8H、IRX9-L、和IRX14-L的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的激活作用Fig.4 The activation of the transcription factors to the reporter gene driven by the promoters of F8H，IRX9-L and IRX14-L

圖5 KNAT7基因顯性抑制的植株的表型Fig.5 The phenotype of the KNAT7 gene dominant repression plant

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)隨著木質(zhì)纖維素作為生物質(zhì)能源被開(kāi)發(fā)利用，木質(zhì)纖維素相關(guān)的合成及降解機(jī)理成為近期的一個(gè)研究熱點(diǎn).其中木質(zhì)素合成酶基因的調(diào)控已有一定的研究，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)有AC元件，并且MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可以與AC元件結(jié)合［26-27］.而對(duì)木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控研究目前還鮮見(jiàn)報(bào)道.這一研究不僅可以為了解木聚糖合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打下基礎(chǔ)，還可以為將來(lái)通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子從上游來(lái)控制木聚糖合成提供理論基礎(chǔ).

我們通過(guò)初步篩選已經(jīng)獲得了多個(gè)可以調(diào)控木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄因子，接下來(lái)我們準(zhǔn)備對(duì)這些啟動(dòng)子進(jìn)行缺失分析，研究這些轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的哪個(gè)區(qū)域結(jié)合.再進(jìn)一步通過(guò)缺失、突變等分析鑒定這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件.另外，雖然體外試驗(yàn)驗(yàn)證了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控作用，而體內(nèi)激活作用依舊需要進(jìn)一步的驗(yàn)證.我們將通過(guò)T-DNA插入突變體以及過(guò)量表達(dá)這些基因，進(jìn)一步分析在植物體內(nèi)木聚糖合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化.

MYB46、KNAT7基因在木聚糖的合成中起著重要的調(diào)控作用.已有研究結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)MYB46基因能激活木聚糖的合成途徑，并且能夠激活FRA8基因的表達(dá)［29］.我們的試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子MYB46不僅能夠激活FRA8基因的表達(dá)，還可以激活基因IRX9、IRX14、F8H和IR14-L的表達(dá).

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【責(zé)任編輯李曉卉】