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    LC-ESI- MS/MS方法測定人血漿肌苷的應(yīng)用研究*

    2014-03-04 05:12:20王洪波張夢亮張蕓輝張寶昌
    重慶醫(yī)學(xué) 2014年3期
    關(guān)鍵詞:肌苷阿德福內(nèi)標(biāo)

    王洪波,張夢亮,張蕓輝,楊 艷,張寶昌△

    (1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,長春130012;2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,長春130012)

    異丙肌苷原為一抗病毒藥,對人體皰疹、流感及鼻病毒感染均有療效,用于單純皰疹病毒感染的患者療效顯著。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)異丙肌苷具有增強機體免疫功能的作用,主要是增強細(xì)胞免疫功能,作為一新的免疫調(diào)節(jié)劑,在國外臨床上廣泛應(yīng)用[1-9]。異丙肌苷由肌苷與二甲胺基異丙醇-對乙酰胺基苯甲酸鹽(1∶3)3部分組成,易水解成為肌苷、二甲胺基異丙醇、對乙酰胺基苯甲酸,以往有關(guān)異丙肌苷的體內(nèi)藥代動力學(xué)報道甚少。本試驗建立了快速、靈敏的測定血漿中肌苷濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析方法,并對4名健康受試者口服1g異丙肌苷后肌苷的體內(nèi)藥代動力學(xué)過程進(jìn)行了初步的研究。

    1 材料與方法

    1.1 儀器和藥品 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,型號 API 4000,配有電噴霧離子源(加拿大Applied Biosystem公司);Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);TGL-16G-A高速臺式冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

    肌苷對照品(濃度為99.8%,上海微蒙生物科技有限公司提供,批號:140669-200702);內(nèi)標(biāo)阿德福韋對照品(濃度99.0%,葛蘭素史克蘇州制藥公司提供,批號:9002);色譜純級別甲醇由Sigma-Aldrich有限公司提供,其他試劑為分析純級別;人血漿由吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 色譜/質(zhì)譜條件 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱,5 μm粒徑,150.0mm×4.6mm I.D.,美國 Agilent公司;流動相:甲醇∶10mmol/L 乙酸銨-水溶液(15∶85,v/v);流速:1mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5μL。質(zhì)譜條件 離子源:ESI離子源;噴射電壓:-4 000V;溫度:500℃;源內(nèi)氣體(N2)GS1、GS2和氣簾氣體壓力分別為:40psi、40psi和15psi;正離子方式檢測;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM);肌苷的解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)分別為-78V和-30eV;內(nèi)標(biāo)阿德福韋的DP和CE分別為-75 V和-50eV;用于定量分析的離子對分別為m/z母離子為267.3,子離子為135.0(肌苷)和 m/z母離子為272.0,子離子為134.1(內(nèi)標(biāo)阿德福韋)。

    1.2.2 樣品采集和處理 全血取出后置肝素化試管中,立即4℃離心(15 000r/min×5min),取出血漿置另一試管(每毫升血漿加100μL 30%高氯酸溶液),充分振蕩混勻,低溫離心(15 000r/min×5min),取上清液,于80℃冷凍待測。室溫溶解,取100μL上清液,立即加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL,充分振搖混勻后,取上清液5μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

    1.2.3 溶液的配制 稱取25.0mg肌苷(分子式:C10H12N4O5)對照品,置于25mL容量瓶中,加甲醇-水定容至刻度,配制成1mg/mL的肌苷母液。

    標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制:取肌苷儲備液適量,分別用室溫放置超過3d后的空白血漿稀釋至10、30、100、300、1 000、3 000 ng/mL。內(nèi)標(biāo)的配制:稱取25.0mg阿德福韋,置于25mL容量瓶中,加甲醇-水定容至刻度,配制成1mg/mL的母液,取適量用甲醇水(1∶1,v/v)稀釋至濃度為1μg/mL,即為內(nèi)標(biāo)溶液。

    2 結(jié) 果

    本試驗參照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)確證[10]。

    2.1 方法的專屬性 分別取6名健康受試者的空白血漿(室溫放置超過3d后的空白血漿)1 000μL,按血漿樣品處理方法操作,得到空白樣品色譜圖(圖1A);將含有10ng/mL肌苷的血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)阿德福韋后,依同法操作,得到定量下限樣品的色譜圖(圖1B);取受試者給藥后收集的血漿樣品,依同法操作,得色譜圖1C。結(jié)果表明:室溫放置超過3d后的空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾肌苷和阿德福韋的測定。

    圖1 測定人血漿中肌苷和內(nèi)標(biāo)阿德福韋的典型MRM色譜圖

    表1 血漿中肌苷LC-MS/MS測定方法的準(zhǔn)確度與精密度(3個分析批,每分析批n=6)

    表2 血漿中肌苷的穩(wěn)定性(n=3)

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量下限 取用空白血漿(室溫放置超過3d后的空白血漿)配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(10、30、100、300、1 000、3 000ng/mL)1000μL,按血漿樣品處理方法操作,取5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析;以肌苷標(biāo)示濃度為橫坐標(biāo),肌苷與內(nèi)標(biāo)物阿德福韋的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo),以加權(quán)系數(shù)W=1/χ2進(jìn)行線性回歸[11],得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。典型的回歸方程曲線為Y=0.001 9 X-0.006 89(r=0.995 4),其中Y為待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比,X為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,血漿中肌苷的線性范圍為10~3 000ng/mL,定量下限(9.8±0.4)ng/mL(n=6)。

    2.3 精密度、準(zhǔn)確度 取空白血漿(室溫放置超過3d的空白血漿)配制的低、中、高3個濃度(30、300、2 400ng/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣品,按血漿樣品處理方法操作,每濃度6樣本,連續(xù)測定3d。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線,計算QC樣品測得濃度,根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的準(zhǔn)確度與精密度,測定血漿中肌苷的準(zhǔn)確度與精密度。見表1。

    2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取一定量空白血漿(室溫放置超過3d的空白血漿),按血漿樣品處理方法(不加入內(nèi)標(biāo))操作,獲得的空白血漿上清液,用此上清液配制低、中、高3個濃度的QC樣品和內(nèi)標(biāo),每濃度4個樣本。將該樣本進(jìn)行LCMS/MS分析,獲得相應(yīng)峰面積,兩種處理方法得到的峰面積比值(百分比)即為提取回收率。血漿樣品中肌苷低、中、高3個濃度回收率分別為(96.7±3.45)%、(93.7±2.60)%、(93.2±2.58)%。用水配制的低、中、高3個濃度(30、300、2 400ng/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣品,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作,每濃度4個樣本;同時取一定量空白血漿(室溫放置超過3 d的空白血漿),按血漿樣品處理方法(不加入內(nèi)標(biāo))操作,獲得的空白血漿上清液,用此上清液配制低、中、高3個濃度的QC樣品和內(nèi)標(biāo),每濃度四樣本,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)峰面積,以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取基質(zhì)效應(yīng),分別為(98.9±9.09)%、(104.8±3.87)%、(102.5±6.20)%。

    2.5 穩(wěn)定性考察 依據(jù)“2.3”項下方法制備穩(wěn)定性QC樣品,每濃度3個樣本,不經(jīng)提取,經(jīng)-80℃放置30d后,測定樣品濃度;或經(jīng)反復(fù)3次-20℃冰凍-溶解循環(huán),測定樣品濃度。結(jié)果(表2)表明:所有凍融試驗測定值與添加值的相對偏差(R.E.%)均小于15%。即血漿樣品可以進(jìn)行反復(fù)凍融或在-80℃放置30d,不會影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確度。

    試驗中對處理后的QC樣品(每濃度3個樣本)進(jìn)行了2.5 h室溫放置穩(wěn)定性考察,結(jié)果顯示所有樣品的試驗測定值與添加值R.E.%均小于15%,說明分析測試過程中的樣品較為穩(wěn)定。

    2.6 分析方法在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用 4例健康受試者,男女各半。試驗方案經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。向受試者解釋知情同意,并簽署受試者知情同意書進(jìn)入該試驗。受試者于服藥前1d入住I期病房,并于第2天8:00口服1g異丙肌苷片(北京賽而生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號:20081215),溫開水200mL送服。臨床醫(yī)生及研究者隨時觀察不良事件并對受試者進(jìn)行監(jiān)護。給藥前、給肌苷藥后10、20、30、45min,1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00h于上肢肘窩靜脈取血5mL,按“1.2.2”操作,以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各時間點的血藥濃度,測得的藥時曲線見圖2。由圖2可見,給藥前,健康受試者血漿基礎(chǔ)肌苷在20~60ng/mL。

    圖2 4名健康受試者口服1g異丙肌苷后肌苷血藥濃度-時間曲線

    3 討 論

    3.1 肌苷作為一種內(nèi)源性核苷類物質(zhì),對其定量分析報道不多。Jeng等[12]用LC-MS/MS同時定量分析了肝癌患者和健康人尿中7種核苷;David等[13]利用微滲析技術(shù)用 HPLCDAD檢測了犬心肌缺血模型細(xì)胞間隙中5種核苷濃度;文獻(xiàn)[14-15]報道用HPLC-DAD或HPLC-UV測定人血漿中內(nèi)源性肌苷濃度。本實驗建立了人血漿肌苷LC-MS/MS分析方法,該方法靈敏度高(定量下限10ng/mL),分析時間短,處理方法簡單(一步沉淀蛋白),試用于高通量的藥代動力學(xué)研究或臨床樣本檢測。該方法已應(yīng)用于健康受試者口服異丙肌苷后的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

    3.2 肌苷在全血和血漿中均不穩(wěn)定。在全血中,嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)快速代謝肌苷成為次黃嘌呤(t1/2<5min);在血漿中,PNP的活力相對較低[14]。因此,為保證樣品在處理過程中的穩(wěn)定性,盡快按照“1.2.2”處理,置-80℃冰箱保存。高氯酸可以破壞酶的活性,所以高氯酸處理過的樣品相對穩(wěn)定。實驗證明含肌苷的新鮮大鼠血漿處理后上清-80℃下至少穩(wěn)定30d。同時未處理的含肌苷的新鮮血漿室溫放置一段時間(3d)后肌苷完全降解,可以用來作為空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,不干擾肌苷和內(nèi)標(biāo)阿德福韋的定量分析。

    3.3 4例受試者的血藥濃度-時間曲線見圖2。由圖可見,4名受試者的藥-時曲線均呈現(xiàn)不規(guī)律的多峰現(xiàn)象,推測其原因可能是多方面的。肌苷為機體內(nèi)源性物質(zhì),內(nèi)源性肌苷的干擾無法避免;在人體內(nèi),肌苷的變化途徑復(fù)雜,作為嘌呤代謝過程中一個中間代謝產(chǎn)物,可以由腺苷、次黃嘌呤核苷酸和次黃嘌呤生成肌苷,同時肌苷也能通過不同途徑代謝成次黃嘌呤或次黃嘌呤核苷酸,十幾種酶參與其中,如肌苷酶、核苷磷酸化酶等。很多情況下,機體會針對某種內(nèi)源性物質(zhì)的增多或減少發(fā)生代償反應(yīng),肌苷在人體內(nèi)是否存在這種代償性的保護機制目前尚不明確;另外,有些內(nèi)源性物質(zhì)受飲食、晝夜節(jié)律或生理周期影響明顯,肌苷是否受飲食、晝夜節(jié)律或生理周期的影響還需進(jìn)一步考察。

    本研究建立LC-MS/MS測定人血漿中肌苷濃度的方法并進(jìn)行了方法確證。該方法專屬性強,樣品處理方便,靈敏度高,適用于肌苷臨床藥動學(xué)研究。

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