黑木耳多糖的?；に囇芯?/h1>
2014-03-03 08:27:45劉東敏胡俊飛王振宇
食品工業(yè)科技 2014年20期
張 智，劉東敏，+，胡俊飛，王振宇，于 震
（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）
黑木耳多糖的?；に囇芯?/p>
張 智1，劉東敏1，+，胡俊飛1，王振宇2，*，于 震1
（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）
采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳多糖酰基化工藝，并考察多糖轉(zhuǎn)化后的體外抗凝血作用。結(jié)果表明：采用對羥基苯甲酸作為最佳供體，酰基化的最佳工藝條件是轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，并在此條件下所測的轉(zhuǎn)化率為27.26%。轉(zhuǎn)化后的多糖抗凝血性能提高。
黑木耳多糖，?；?，響應(yīng)面，抗凝血
多糖的衍生化是指通過物理、化學(xué)、生物等方法對多糖分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，期望改變或者產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)的方法對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，修飾后的多糖抗凝血功能大大提高，一般來講，修飾后的?；亩嗵侨芙舛仍黾樱欣谄浠钚缘陌l(fā)揮[1]。
血栓栓塞性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，目前應(yīng)用于臨床治療的抗凝血藥物主要是肝素和香豆素類藥物，有誘發(fā)血小板癥等副作用，開發(fā)具有抗凝血作用的非肝素類藥物及保健食品有著重要的意義。黑木耳又稱云耳、黑菜，是一種質(zhì)優(yōu)的膠質(zhì)食用菌和藥用菌。黑木耳多糖具有抗衰老、抗血栓、預(yù)防高血脂、高血壓、冠心病等作用[2-4]。因而，探索黑木耳多糖對人體血液系統(tǒng)的影響具有重要的意義[5]。本實(shí)驗(yàn)的前期對黑木耳多糖提取、純化及分級(jí)并在此基礎(chǔ)上對多糖進(jìn)行?；?，獲得修飾后的多糖在進(jìn)行體外抗凝血實(shí)驗(yàn)，為把黑木耳多糖及其衍生物進(jìn)一步開發(fā)成為功能性食品添加劑或者藥品提供相關(guān)的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
東北產(chǎn)黑木耳 將其粉碎過40目篩，脫脂烘干后待用；葡萄糖、石油醚、丙酮、乙醚、等試劑 均為國產(chǎn)分析純；凝血酶時(shí)間測定試劑盒、凝血酶原時(shí)間測定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間測定試劑盒 均購自上海太陽生物技術(shù)有限公司；動(dòng)物 新西蘭白兔，體重2～3kg。
722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司制造；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；TDL-5-W臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
1.2 黑木耳粗多糖的提取純化工藝流程
原料預(yù)處理→90℃水浴浸提2h（1∶70），復(fù)提1次→4000r/min離心10min，取上清液→50℃減壓濃縮→除蛋白（Sevage法3次脫蛋白）→95%乙醇醇沉→離心取沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀→50℃烘干，得粗多糖（CAAP），復(fù)溶→自來水透析24h→蒸餾水透析24h→50℃烘干→精制多糖（AAP）[6]。
1.3 黑木耳粗多糖的得率、純度計(jì)算
按照樊黎生[7]文獻(xiàn)中的方法計(jì)算多糖得率及多糖純度：
黑木耳粗多糖得率（%）=（CAAP重（g）/子實(shí)體粉粒重（g））×100
精 制 多 糖（AAP）的 純 度（%）=（AAP 多 糖 含 量（mg）/AAP重（mg））×100
1.4 黑木耳多糖的分級(jí)純化
1.4.1 酸性多糖的制備 按照李公斌[8]文獻(xiàn)中的方法制備酸性多糖。
1.4.2 多糖分級(jí) 用水復(fù)溶酸性多糖，然后加乙醇至終濃度40%沉淀得AAP1，上清液加乙醇至終濃度60%得到沉淀AAP2，再將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)烘干得到AAP3。
1.5 木耳多糖的衍生化實(shí)驗(yàn)
1.5.1 木耳多糖轉(zhuǎn)化率的測定 將多糖制成溶液，采用NaOH滴定方法，用酚酞做指示劑，根據(jù)以下公式計(jì)算出轉(zhuǎn)化率：
式中，m0—反應(yīng)初始加入的供體，mg；c—NaOH的濃度，mol/L；ΔV—多糖加入酸后的消耗的與轉(zhuǎn)化后最終滴定消耗的NaOH體積之差，mL；M—供體的分子量；n—供體游離的H+個(gè)數(shù)。
1.5.2 木耳多糖的衍生化 將濃度為5mg/mL具有較好抗凝血效果的黑木耳多糖樣品與供體按照一定的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，水浴加熱一定時(shí)間后，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。合成后的產(chǎn)品在透析袋用中流動(dòng)的水透析3d。最后濃縮、醇沉、并冷凍干燥后得衍生化的木耳多糖[9]。
1.5.3 供體基團(tuán)的選擇 將濃度為5mg/mL黑木耳多糖樣品分別與供體L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸、對羥基苯甲酸等按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳供體基團(tuán)。
1.5.4 單因素最佳轉(zhuǎn)化條件的實(shí)驗(yàn) 分別以底物與供體比例、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、多糖濃度四因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，按照1.5.2中的操作，以各個(gè)因素為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。
1.5.4.1 最佳多糖濃度 將濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳底物濃度。
1.5.4.2 最 佳 底 物 與 供 體 比 例 將 濃 度 分 別 為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體分別按照1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳的底物與供體比例。
1.5.4.3 最佳轉(zhuǎn)化溫度 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，分別在40、45、50、55、60、65℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳轉(zhuǎn)化溫度。
1.5.4.4 最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，55℃分別水浴2、3、4、5、6、7h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間。
1.5.5 最佳轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，并選取上述多糖濃度、底物與供體比例、轉(zhuǎn)化溫度3個(gè)因素通過Design-expert 8.05軟件利用Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并據(jù)此建立數(shù)學(xué)回歸模型，做響應(yīng)面分析。響應(yīng)面優(yōu)化因素水平設(shè)計(jì)表如表1所示。
表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 The coding table of factor and level
1.5.6 木耳多糖的紅外光譜分析 木耳多糖及其化學(xué)修飾產(chǎn)物經(jīng)溴化鉀壓片后，進(jìn)行紅外光譜分析。
1.6 體外抗凝血
1.6.1 抗凝血實(shí)驗(yàn) 新西蘭兔正常喂養(yǎng)，從脖子動(dòng)脈取血：將全血置于含有檸檬酸鈉抗凝液（1份抗凝液+9份全血）的塑料管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心15min，取上清液，即待測血漿。取按照試劑盒說明，采用手工方法測定活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血漿凝血酶原時(shí)間（prothromtin time，PT）、血漿凝血酶時(shí)間（thromtin time，TT）[10]。
1.6.2 三種級(jí)分的木耳多糖抗凝血對比 將AAP1、AAP2和AAP3配成0.5mg/mL的溶液，按照1.6.1方法進(jìn)行體外抗凝血實(shí)驗(yàn)，并將具有較好的抗凝血效果的級(jí)分作為下面微生物轉(zhuǎn)化的原料。
1.6.3 ?；嗵堑目鼓獙?shí)驗(yàn) 將未轉(zhuǎn)化的多糖和轉(zhuǎn)化的多糖進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)，觀察?；蟮暮谀径嗵堑目鼓Ч?。
1.6.4 數(shù) 據(jù) 分 析 本 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 統(tǒng) 計(jì) 采 用SPSS 17.0分析軟件對黑木耳多糖抗凝血作用進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 木耳多糖的提取與純化
木耳多糖經(jīng)醇沉烘干后得到粗多糖（CAAP），得率為7.89%，低于文獻(xiàn)報(bào)道中得率，估計(jì)是提取次數(shù)太少以及Sevage法3次除蛋白過程中損失的多糖較大。透析完后獲得的精制多糖（AAP）純度為81.3%。
2.2 酸性多糖的制備及分級(jí)
將1.0%精制多糖（AAP）分成酸性多糖、中性多糖，兩種多糖分別占66.08%、33.93%，本文的數(shù)據(jù)與李公斌[8]的數(shù)據(jù)相差較大，主要原因是在獲得酸性多糖沉底后，要經(jīng)過解離和透析，中間過程造成多糖損失較大，因此造成酸性多糖所占比例降低。然后將酸性多糖按照1.4.2進(jìn)行分級(jí)得到AAP1、AAP2、AAP3三種多糖，分別占33.55%、23.48%、42.97%。
2.3 木耳多糖的衍生化實(shí)驗(yàn)
2.3.1 供體基團(tuán)的選擇 將具有較好抗凝血效果的AAP3與供體按5∶1的比例混合，50℃反應(yīng)6h后得到結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，加入對羥基苯甲酸獲得的轉(zhuǎn)化率最高，多糖轉(zhuǎn)化程度最高，其次是L-半胱氨酸，L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸轉(zhuǎn)化率在15%以內(nèi)，結(jié)果表明對羥基苯甲酸可以提高多糖的轉(zhuǎn)化率。
圖1 各種酸類的比較Fig.1 Compare with several acid
2.3.2 多糖轉(zhuǎn)化的單因素實(shí)驗(yàn)
2.3.2.1 多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響 圖2反映了多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響情況。隨著多糖濃度的增加，轉(zhuǎn)化率在1.0mg/mL之前增加，之后再呈下降趨勢，原因可能是木耳粘多糖的粘度增加導(dǎo)致供體酸不能充分接觸，轉(zhuǎn)化率降低。
圖2 多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of polysaccharide concentration on conversion rate
2.3.2.2 底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響 圖3反映了底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響，隨著比例的增加在底物與供體比例為10∶1處，轉(zhuǎn)化率先增加后減小?？赡苁窃诠w一定的情況下，隨著多糖的增加供體能夠充分和多糖反應(yīng)，但多糖的粘度也隨之增加，導(dǎo)致當(dāng)粘度增加到某點(diǎn)時(shí)，供體與多糖不能充分接觸，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。
圖3 底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of the ratio of polysaccharide to acyl donor on conversion rate
2.3.2.3 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響 圖4反映了轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響，隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率先升高后降低，轉(zhuǎn)化溫度在55℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值。溫度升高可以降低多糖的粘度，轉(zhuǎn)化率升高，但是溫度太高會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低，故選擇最佳轉(zhuǎn)化溫度為55℃。
圖4 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of conversion temperature on conversion rate
2.3.2.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響 圖5顯示了轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響。隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增長轉(zhuǎn)化率一直呈上升趨勢，在轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h處轉(zhuǎn)化率增長趨于平緩，這說明到轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h時(shí)，轉(zhuǎn)化基本結(jié)束，綜合經(jīng)濟(jì)成本的考慮，選擇最佳的轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h。
圖5 轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of conversion time on conversion rate
2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件
2.3.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。根據(jù) Box-Behnken 法 擬 合 出 的 回 歸 方 程 ：Y=26.90 －0.23A＋1.15B－0.84C－3.80A2－8.29B2－0.47C2－0.16AB＋0.25AC－0.11BC。
表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experiment design and estimated values of response surface
2.3.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析 對上述模型方程進(jìn)行方差分析，各因素的方差分析結(jié)果如表3所示。由該表數(shù)據(jù)可知，此模型是顯著的（p＜0.0001）。失擬性值其Prob＞F值為0.2520（p＞0.05），說明該模型的擬合度較好。
底物與供體比例的影響最大，其Prob＞F值為小于0.0001，達(dá)到了極顯著水平；轉(zhuǎn)化溫度影響較小，但其Prob＞F值為0.0428 （p＜0.05），也達(dá)到了顯著水平。各因素對結(jié)果的影響按大小排序依次為B（底物與供體比例）、C（多糖濃度）和A（轉(zhuǎn)化溫度）。
由表3可知，各因素之間的交互作用對轉(zhuǎn)化率的影響不大。A2、B2酰基化工藝影響很大，其Prob＞F值均小于0.0001，達(dá)到了極顯著水平，C2也對?；に囉绊懞艽螅琍rob＞F值為0.0075，達(dá)到了顯著水平。
圖6～圖8直觀地反映了各因素之間的交互作用及其對響應(yīng)值的影響。按照回歸模型預(yù)測的多糖衍生化的最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度54.69℃，底物與供體比例10.38∶1，多糖濃度0.54mg/mL，在此條件下，多糖衍生化轉(zhuǎn)化率理論上可達(dá)到27.33%。根據(jù)實(shí)踐操作的可行性考慮，校正最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。
表3 方差分析Table 3 Variance analysis of factors of response surface
圖6 轉(zhuǎn)化溫度和底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of conversion temperature and the ratio of polysaccharide to acyl donor to the conversion rate
圖7 轉(zhuǎn)化溫度和多糖濃度對轉(zhuǎn)化率工藝影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of conversion temperature and polysaccharide concentration to the conversion rate
2.3.3.3 驗(yàn) 證 實(shí) 驗(yàn) 根 據(jù) 上 述 優(yōu) 化 結(jié) 果 ，轉(zhuǎn) 化 溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，轉(zhuǎn)化時(shí)間4h的優(yōu)化工藝條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測得多糖轉(zhuǎn)化率分別為27.29%、27.26%、27.24%，平均值為27.26%。驗(yàn)證結(jié)果與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)預(yù)測的結(jié)果27.27%沒有顯著性差異，說明預(yù)測方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。
圖8 多糖濃度和底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface graph of the ratio of Polysaccharide to acyl donor and polysaccharide concentration to the conversion rate
2.3.4 ?；径嗵堑募t外光譜 將?；漠a(chǎn)物與未?；亩嗵菢悠吩诜直媛蕿?cm-1的Avatar型紅外譜儀上進(jìn)行紅外檢測，波數(shù)400～4000cm-1，掃描32次。譜圖如圖9及圖10所示。
圖9 未?；嗵堑募t外掃描圖譜Fig.9 IR analysis of polysaccharide without the derivatization
圖10 酰基化多糖的紅外掃描圖譜Fig.10 IR analysis of polysaccharide by the derivatization
圖9和圖10圖譜中均在3400cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)的-O-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收特征峰，說明多糖鏈上的羥基未完全被酰基所取代，同時(shí)可以看出酰基化多糖在3430.27cm-1處的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酰基化。另外，在2900cm-1附近的峰為多糖單 元 上-CH2-不 對 稱 振 動(dòng) 吸 收 。 圖10中1551.12、1462.45、1455.36cm-1可能是芳烴骨架C=C鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，而圖9中未出現(xiàn)，說明未?；亩嗵且呀?jīng)連接上了對羥基苯甲酸，同時(shí)在1746.33cm-1處有一吸收峰為多糖?；驝=O鍵的吸收峰，以上充分說明多糖?；晒?。
2.4 體外抗凝血實(shí)驗(yàn)
2.4.1 分級(jí)多糖（AAP1、AAP2、AAP3）體外抗凝血功能對比 將多糖配成0.5mg/mL濃度的溶液，按照試劑盒說明書操作，對多糖進(jìn)行PT、APTT和TT實(shí)驗(yàn)，如表4所示。從表4中數(shù)據(jù)可看出多糖級(jí)分AAP1、AAP2、AAP3抗凝血作用逐漸增加，所以選擇具有抗凝血作用較好的AAP3作為多糖衍生的原料。
表4 多糖AAP1、AAP2、AAP3對PT、APTT和TT的影響Table 4 Effect of polysaccharide AAP1，AAP2 and AAP3 on PT，APTT and TT
2.4.2 衍生化多糖與未衍生化多糖體外抗凝血功能對比 從表5中的數(shù)據(jù)可觀察到衍生后的多糖對體外抗凝血效果大大增加，可能因?yàn)檗D(zhuǎn)化后多糖的溶解度增加，粘度減低，從而使多糖活性增強(qiáng)[11]。
表5 轉(zhuǎn)化的多糖（AAP3-I）對PT、APTT和TT的影響Table 5 Effect of conversion polysaccharide on PT，APTT and TT
3 結(jié)論
木耳多糖能延長血漿凝固時(shí)間，并且經(jīng)過?；揎椇?，能明顯提高其抗凝血效果，具有被開發(fā)成功能食品或者藥品的潛在價(jià)值。采用具有較好抗凝血作用的級(jí)分AAP3加入對羥基苯甲酸制備木耳多糖衍生物，并通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究，得到酰基化合成修飾的最優(yōu)工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。根據(jù)最優(yōu)工藝條件制備得到的木耳多糖?；蟮亩嗵茄苌锏霓D(zhuǎn)化率約為27.26%，符合藥理性研究要求，該方法操作簡單，反應(yīng)條件相對簡單、產(chǎn)物回收方便，是一種較理想的衍生化方法。
[1]賴萍，林躍鑫.天然多糖分子修飾研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2003，23（3）：183.
[2]Zhang Hua，Wang Zhen yu.In vitro antioxidant activities of sulfated derivatives of polysaccharides extracted from Auricularia auricular[J].International Journal of Molecular Sciences，2011，12（5）：3288-3302.
[3]葉挺梅，錢令波，崔潔，等.黑木耳多糖對抗離體心臟缺血再灌注損傷的研 究[J]. 中 國應(yīng) 用生理學(xué) 雜志，2010，26（2）：154-158.
[4]Li Ling，Ding Jun-nan，Luo Li，et al.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular[J].Journal of Forestry Research，2005，16（1）：61-64.
[5]陳和生，孫振亞.黑木耳多糖的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（5）：300-301.
[6]歐陽天贄，謝九皋.堿溶性黑木耳多糖分離、純化和表征[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18（1）：46-48.
[7]樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa級(jí)分的制備及其生物活性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.
[8]李公斌. 黑木耳多 糖分子修飾 及功能與應(yīng)用研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2006.
[9]宋逍，張麗華，趙鵬，等.響應(yīng)面法優(yōu)選款冬花多糖的乙?；に囇芯縖J].中成藥，2013，35（9）：3030-2033.
[10]李敬，魏玉西，杜桂彩.鼠尾藻多酚的抗凝血活性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（3）：191-194.
[11]梁進(jìn)，張劍韻，崔瑩瑩.茶多糖的化學(xué)修飾及體外抗凝血作用研究[J].茶葉科學(xué)，2008，28（3）：166-171.
Study on derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular
ZHANG Zhi1，LIU Dong-min1，+，HU Jun-fei1，WANG Zhen-yu2，*，YU Zhen1
（1.Department of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）
Derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular was optimized by using Response Surface Methodology，and examining the effect of anticoagulant in vitro after polysaccharide transforming as well.The results showed that selecting p-hydroxybenzoic acid as acyl donor，the best process condition of derivatization of conversion temperature of 55℃，the ratio of polysaccharide to acyl donor of 10∶1，polysaccharide concentration of 0.50mg/mL，that was the most effective condition.The optimal conversion rate was 27.26% under this condition.Conversion polysaccharide could improve the effect of anticoagulant in vitro.
Auricularia auricular polysaccharide；derivatization；response surface methodology；anticoagulant
TS201.1
B
1002-0306（2014）20-0263-06
10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.049
2014－01－15 +為并列第一作者
張智（1964-），女，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化。劉東敏（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。
* 通訊作者：王振宇（1957-），男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離與功能性食品開發(fā)。
猜你喜歡
N-月桂?；劝彼猁}性能的pH依賴性中國洗滌用品工業(yè)(2017年2期)2017-04-16 05:07:45 不同氫供體對碳納米管負(fù)載鈀催化劑催化溴苯脫溴加氫反應(yīng)的影響當(dāng)代化工研究(2016年7期)2016-03-20 16:21:50 當(dāng)代化工研究(2016年2期)2016-03-20 16:21:23 抗凝血類滅鼠劑中毒的診治分析災(zāi)害醫(yī)學(xué)與救援(電子版)(2016年3期)2016-03-11 20:18:06 N-脂肪?；被猁}的合成、性能及應(yīng)用中國洗滌用品工業(yè)(2016年2期)2016-02-28 19:03:17 肝素抗凝血漿用于急診生化檢驗(yàn)的價(jià)值分析中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理(2015年3期)2016-01-14 03:41:43 藏北草原第一代抗凝血滅鼠劑應(yīng)用技術(shù)研究西藏科技(2015年6期)2015-09-26 12:12:14 高齡供體的肝移植受者生存分析實(shí)用器官移植電子雜志(2015年1期)2015-04-02 14:58:26 終末熱灌注對心臟移植術(shù)中豬供體心臟的保護(hù)作用鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)(2015年2期)2015-02-27 14:50:44 α-甲氧甲酰基-γ-丁內(nèi)酯和α-乙氧甲?；?γ-丁內(nèi)酯的合成及表應(yīng)用化工(2014年5期)2014-08-08 13:10:58
張 智，劉東敏，+，胡俊飛，王振宇，于 震
（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）
黑木耳多糖的?；に囇芯?/p>
張 智1，劉東敏1，+，胡俊飛1，王振宇2，*，于 震1
（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090）
采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳多糖酰基化工藝，并考察多糖轉(zhuǎn)化后的體外抗凝血作用。結(jié)果表明：采用對羥基苯甲酸作為最佳供體，酰基化的最佳工藝條件是轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，并在此條件下所測的轉(zhuǎn)化率為27.26%。轉(zhuǎn)化后的多糖抗凝血性能提高。
黑木耳多糖，?；?，響應(yīng)面，抗凝血
多糖的衍生化是指通過物理、化學(xué)、生物等方法對多糖分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，期望改變或者產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)的方法對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，修飾后的多糖抗凝血功能大大提高，一般來講，修飾后的?；亩嗵侨芙舛仍黾樱欣谄浠钚缘陌l(fā)揮[1]。
血栓栓塞性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，目前應(yīng)用于臨床治療的抗凝血藥物主要是肝素和香豆素類藥物，有誘發(fā)血小板癥等副作用，開發(fā)具有抗凝血作用的非肝素類藥物及保健食品有著重要的意義。黑木耳又稱云耳、黑菜，是一種質(zhì)優(yōu)的膠質(zhì)食用菌和藥用菌。黑木耳多糖具有抗衰老、抗血栓、預(yù)防高血脂、高血壓、冠心病等作用[2-4]。因而，探索黑木耳多糖對人體血液系統(tǒng)的影響具有重要的意義[5]。本實(shí)驗(yàn)的前期對黑木耳多糖提取、純化及分級(jí)并在此基礎(chǔ)上對多糖進(jìn)行?；?，獲得修飾后的多糖在進(jìn)行體外抗凝血實(shí)驗(yàn)，為把黑木耳多糖及其衍生物進(jìn)一步開發(fā)成為功能性食品添加劑或者藥品提供相關(guān)的理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
東北產(chǎn)黑木耳 將其粉碎過40目篩，脫脂烘干后待用；葡萄糖、石油醚、丙酮、乙醚、等試劑 均為國產(chǎn)分析純；凝血酶時(shí)間測定試劑盒、凝血酶原時(shí)間測定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間測定試劑盒 均購自上海太陽生物技術(shù)有限公司；動(dòng)物 新西蘭白兔，體重2～3kg。
722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司制造；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；TDL-5-W臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
1.2 黑木耳粗多糖的提取純化工藝流程
原料預(yù)處理→90℃水浴浸提2h（1∶70），復(fù)提1次→4000r/min離心10min，取上清液→50℃減壓濃縮→除蛋白（Sevage法3次脫蛋白）→95%乙醇醇沉→離心取沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀→50℃烘干，得粗多糖（CAAP），復(fù)溶→自來水透析24h→蒸餾水透析24h→50℃烘干→精制多糖（AAP）[6]。
1.3 黑木耳粗多糖的得率、純度計(jì)算
按照樊黎生[7]文獻(xiàn)中的方法計(jì)算多糖得率及多糖純度：
黑木耳粗多糖得率（%）=（CAAP重（g）/子實(shí)體粉粒重（g））×100
精 制 多 糖（AAP）的 純 度（%）=（AAP 多 糖 含 量（mg）/AAP重（mg））×100
1.4 黑木耳多糖的分級(jí)純化
1.4.1 酸性多糖的制備 按照李公斌[8]文獻(xiàn)中的方法制備酸性多糖。
1.4.2 多糖分級(jí) 用水復(fù)溶酸性多糖，然后加乙醇至終濃度40%沉淀得AAP1，上清液加乙醇至終濃度60%得到沉淀AAP2，再將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)烘干得到AAP3。
1.5 木耳多糖的衍生化實(shí)驗(yàn)
1.5.1 木耳多糖轉(zhuǎn)化率的測定 將多糖制成溶液，采用NaOH滴定方法，用酚酞做指示劑，根據(jù)以下公式計(jì)算出轉(zhuǎn)化率：
式中，m0—反應(yīng)初始加入的供體，mg；c—NaOH的濃度，mol/L；ΔV—多糖加入酸后的消耗的與轉(zhuǎn)化后最終滴定消耗的NaOH體積之差，mL；M—供體的分子量；n—供體游離的H+個(gè)數(shù)。
1.5.2 木耳多糖的衍生化 將濃度為5mg/mL具有較好抗凝血效果的黑木耳多糖樣品與供體按照一定的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，水浴加熱一定時(shí)間后，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。合成后的產(chǎn)品在透析袋用中流動(dòng)的水透析3d。最后濃縮、醇沉、并冷凍干燥后得衍生化的木耳多糖[9]。
1.5.3 供體基團(tuán)的選擇 將濃度為5mg/mL黑木耳多糖樣品分別與供體L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸、對羥基苯甲酸等按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳供體基團(tuán)。
1.5.4 單因素最佳轉(zhuǎn)化條件的實(shí)驗(yàn) 分別以底物與供體比例、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、多糖濃度四因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，按照1.5.2中的操作，以各個(gè)因素為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。
1.5.4.1 最佳多糖濃度 將濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照5∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳底物濃度。
1.5.4.2 最 佳 底 物 與 供 體 比 例 將 濃 度 分 別 為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體分別按照1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，50℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳的底物與供體比例。
1.5.4.3 最佳轉(zhuǎn)化溫度 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，分別在40、45、50、55、60、65℃水浴6h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳轉(zhuǎn)化溫度。
1.5.4.4 最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間 將濃度分別為1.0mg/mL黑木耳多糖樣品分別與最佳供體按照10∶1的比例混合，室溫下振蕩20min使其充分溶解，55℃分別水浴2、3、4、5、6、7h進(jìn)行反應(yīng)，NaOH滴定，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，選擇最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間。
1.5.5 最佳轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，并選取上述多糖濃度、底物與供體比例、轉(zhuǎn)化溫度3個(gè)因素通過Design-expert 8.05軟件利用Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并據(jù)此建立數(shù)學(xué)回歸模型，做響應(yīng)面分析。響應(yīng)面優(yōu)化因素水平設(shè)計(jì)表如表1所示。
表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 The coding table of factor and level
1.5.6 木耳多糖的紅外光譜分析 木耳多糖及其化學(xué)修飾產(chǎn)物經(jīng)溴化鉀壓片后，進(jìn)行紅外光譜分析。
1.6 體外抗凝血
1.6.1 抗凝血實(shí)驗(yàn) 新西蘭兔正常喂養(yǎng)，從脖子動(dòng)脈取血：將全血置于含有檸檬酸鈉抗凝液（1份抗凝液+9份全血）的塑料管中，輕輕顛倒混勻，3000r/min離心15min，取上清液，即待測血漿。取按照試劑盒說明，采用手工方法測定活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、血漿凝血酶原時(shí)間（prothromtin time，PT）、血漿凝血酶時(shí)間（thromtin time，TT）[10]。
1.6.2 三種級(jí)分的木耳多糖抗凝血對比 將AAP1、AAP2和AAP3配成0.5mg/mL的溶液，按照1.6.1方法進(jìn)行體外抗凝血實(shí)驗(yàn)，并將具有較好的抗凝血效果的級(jí)分作為下面微生物轉(zhuǎn)化的原料。
1.6.3 ?；嗵堑目鼓獙?shí)驗(yàn) 將未轉(zhuǎn)化的多糖和轉(zhuǎn)化的多糖進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)，觀察?；蟮暮谀径嗵堑目鼓Ч?。
1.6.4 數(shù) 據(jù) 分 析 本 實(shí) 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 統(tǒng) 計(jì) 采 用SPSS 17.0分析軟件對黑木耳多糖抗凝血作用進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 木耳多糖的提取與純化
木耳多糖經(jīng)醇沉烘干后得到粗多糖（CAAP），得率為7.89%，低于文獻(xiàn)報(bào)道中得率，估計(jì)是提取次數(shù)太少以及Sevage法3次除蛋白過程中損失的多糖較大。透析完后獲得的精制多糖（AAP）純度為81.3%。
2.2 酸性多糖的制備及分級(jí)
將1.0%精制多糖（AAP）分成酸性多糖、中性多糖，兩種多糖分別占66.08%、33.93%，本文的數(shù)據(jù)與李公斌[8]的數(shù)據(jù)相差較大，主要原因是在獲得酸性多糖沉底后，要經(jīng)過解離和透析，中間過程造成多糖損失較大，因此造成酸性多糖所占比例降低。然后將酸性多糖按照1.4.2進(jìn)行分級(jí)得到AAP1、AAP2、AAP3三種多糖，分別占33.55%、23.48%、42.97%。
2.3 木耳多糖的衍生化實(shí)驗(yàn)
2.3.1 供體基團(tuán)的選擇 將具有較好抗凝血效果的AAP3與供體按5∶1的比例混合，50℃反應(yīng)6h后得到結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，加入對羥基苯甲酸獲得的轉(zhuǎn)化率最高，多糖轉(zhuǎn)化程度最高，其次是L-半胱氨酸，L-蘋果酸、丁二酸、丙二酸轉(zhuǎn)化率在15%以內(nèi)，結(jié)果表明對羥基苯甲酸可以提高多糖的轉(zhuǎn)化率。
圖1 各種酸類的比較Fig.1 Compare with several acid
2.3.2 多糖轉(zhuǎn)化的單因素實(shí)驗(yàn)
2.3.2.1 多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響 圖2反映了多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響情況。隨著多糖濃度的增加，轉(zhuǎn)化率在1.0mg/mL之前增加，之后再呈下降趨勢，原因可能是木耳粘多糖的粘度增加導(dǎo)致供體酸不能充分接觸，轉(zhuǎn)化率降低。
圖2 多糖濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of polysaccharide concentration on conversion rate
2.3.2.2 底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響 圖3反映了底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響，隨著比例的增加在底物與供體比例為10∶1處，轉(zhuǎn)化率先增加后減小?？赡苁窃诠w一定的情況下，隨著多糖的增加供體能夠充分和多糖反應(yīng)，但多糖的粘度也隨之增加，導(dǎo)致當(dāng)粘度增加到某點(diǎn)時(shí)，供體與多糖不能充分接觸，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。
圖3 底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of the ratio of polysaccharide to acyl donor on conversion rate
2.3.2.3 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響 圖4反映了轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響，隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率先升高后降低，轉(zhuǎn)化溫度在55℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值。溫度升高可以降低多糖的粘度，轉(zhuǎn)化率升高，但是溫度太高會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低，故選擇最佳轉(zhuǎn)化溫度為55℃。
圖4 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of conversion temperature on conversion rate
2.3.2.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響 圖5顯示了轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響。隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增長轉(zhuǎn)化率一直呈上升趨勢，在轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h處轉(zhuǎn)化率增長趨于平緩，這說明到轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h時(shí)，轉(zhuǎn)化基本結(jié)束，綜合經(jīng)濟(jì)成本的考慮，選擇最佳的轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.0h。
圖5 轉(zhuǎn)化時(shí)間對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of conversion time on conversion rate
2.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件
2.3.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Box-Benhnken中心組合方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。根據(jù) Box-Behnken 法 擬 合 出 的 回 歸 方 程 ：Y=26.90 －0.23A＋1.15B－0.84C－3.80A2－8.29B2－0.47C2－0.16AB＋0.25AC－0.11BC。
表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experiment design and estimated values of response surface
2.3.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析 對上述模型方程進(jìn)行方差分析，各因素的方差分析結(jié)果如表3所示。由該表數(shù)據(jù)可知，此模型是顯著的（p＜0.0001）。失擬性值其Prob＞F值為0.2520（p＞0.05），說明該模型的擬合度較好。
底物與供體比例的影響最大，其Prob＞F值為小于0.0001，達(dá)到了極顯著水平；轉(zhuǎn)化溫度影響較小，但其Prob＞F值為0.0428 （p＜0.05），也達(dá)到了顯著水平。各因素對結(jié)果的影響按大小排序依次為B（底物與供體比例）、C（多糖濃度）和A（轉(zhuǎn)化溫度）。
由表3可知，各因素之間的交互作用對轉(zhuǎn)化率的影響不大。A2、B2酰基化工藝影響很大，其Prob＞F值均小于0.0001，達(dá)到了極顯著水平，C2也對?；に囉绊懞艽螅琍rob＞F值為0.0075，達(dá)到了顯著水平。
圖6～圖8直觀地反映了各因素之間的交互作用及其對響應(yīng)值的影響。按照回歸模型預(yù)測的多糖衍生化的最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度54.69℃，底物與供體比例10.38∶1，多糖濃度0.54mg/mL，在此條件下，多糖衍生化轉(zhuǎn)化率理論上可達(dá)到27.33%。根據(jù)實(shí)踐操作的可行性考慮，校正最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。
表3 方差分析Table 3 Variance analysis of factors of response surface
圖6 轉(zhuǎn)化溫度和底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of conversion temperature and the ratio of polysaccharide to acyl donor to the conversion rate
圖7 轉(zhuǎn)化溫度和多糖濃度對轉(zhuǎn)化率工藝影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of conversion temperature and polysaccharide concentration to the conversion rate
2.3.3.3 驗(yàn) 證 實(shí) 驗(yàn) 根 據(jù) 上 述 優(yōu) 化 結(jié) 果 ，轉(zhuǎn) 化 溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL，轉(zhuǎn)化時(shí)間4h的優(yōu)化工藝條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測得多糖轉(zhuǎn)化率分別為27.29%、27.26%、27.24%，平均值為27.26%。驗(yàn)證結(jié)果與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)預(yù)測的結(jié)果27.27%沒有顯著性差異，說明預(yù)測方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。
圖8 多糖濃度和底物與供體比例對轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface graph of the ratio of Polysaccharide to acyl donor and polysaccharide concentration to the conversion rate
2.3.4 ?；径嗵堑募t外光譜 將?；漠a(chǎn)物與未?；亩嗵菢悠吩诜直媛蕿?cm-1的Avatar型紅外譜儀上進(jìn)行紅外檢測，波數(shù)400～4000cm-1，掃描32次。譜圖如圖9及圖10所示。
圖9 未?；嗵堑募t外掃描圖譜Fig.9 IR analysis of polysaccharide without the derivatization
圖10 酰基化多糖的紅外掃描圖譜Fig.10 IR analysis of polysaccharide by the derivatization
圖9和圖10圖譜中均在3400cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)的-O-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收特征峰，說明多糖鏈上的羥基未完全被酰基所取代，同時(shí)可以看出酰基化多糖在3430.27cm-1處的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酰基化。另外，在2900cm-1附近的峰為多糖單 元 上-CH2-不 對 稱 振 動(dòng) 吸 收 。 圖10中1551.12、1462.45、1455.36cm-1可能是芳烴骨架C=C鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，而圖9中未出現(xiàn)，說明未?；亩嗵且呀?jīng)連接上了對羥基苯甲酸，同時(shí)在1746.33cm-1處有一吸收峰為多糖?；驝=O鍵的吸收峰，以上充分說明多糖?；晒?。
2.4 體外抗凝血實(shí)驗(yàn)
2.4.1 分級(jí)多糖（AAP1、AAP2、AAP3）體外抗凝血功能對比 將多糖配成0.5mg/mL濃度的溶液，按照試劑盒說明書操作，對多糖進(jìn)行PT、APTT和TT實(shí)驗(yàn)，如表4所示。從表4中數(shù)據(jù)可看出多糖級(jí)分AAP1、AAP2、AAP3抗凝血作用逐漸增加，所以選擇具有抗凝血作用較好的AAP3作為多糖衍生的原料。
表4 多糖AAP1、AAP2、AAP3對PT、APTT和TT的影響Table 4 Effect of polysaccharide AAP1，AAP2 and AAP3 on PT，APTT and TT
2.4.2 衍生化多糖與未衍生化多糖體外抗凝血功能對比 從表5中的數(shù)據(jù)可觀察到衍生后的多糖對體外抗凝血效果大大增加，可能因?yàn)檗D(zhuǎn)化后多糖的溶解度增加，粘度減低，從而使多糖活性增強(qiáng)[11]。
表5 轉(zhuǎn)化的多糖（AAP3-I）對PT、APTT和TT的影響Table 5 Effect of conversion polysaccharide on PT，APTT and TT
3 結(jié)論
木耳多糖能延長血漿凝固時(shí)間，并且經(jīng)過?；揎椇?，能明顯提高其抗凝血效果，具有被開發(fā)成功能食品或者藥品的潛在價(jià)值。采用具有較好抗凝血作用的級(jí)分AAP3加入對羥基苯甲酸制備木耳多糖衍生物，并通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究，得到酰基化合成修飾的最優(yōu)工藝條件為：轉(zhuǎn)化溫度55℃，底物與供體比例10∶1，多糖濃度0.50mg/mL。根據(jù)最優(yōu)工藝條件制備得到的木耳多糖?；蟮亩嗵茄苌锏霓D(zhuǎn)化率約為27.26%，符合藥理性研究要求，該方法操作簡單，反應(yīng)條件相對簡單、產(chǎn)物回收方便，是一種較理想的衍生化方法。
[1]賴萍，林躍鑫.天然多糖分子修飾研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2003，23（3）：183.
[2]Zhang Hua，Wang Zhen yu.In vitro antioxidant activities of sulfated derivatives of polysaccharides extracted from Auricularia auricular[J].International Journal of Molecular Sciences，2011，12（5）：3288-3302.
[3]葉挺梅，錢令波，崔潔，等.黑木耳多糖對抗離體心臟缺血再灌注損傷的研 究[J]. 中 國應(yīng) 用生理學(xué) 雜志，2010，26（2）：154-158.
[4]Li Ling，Ding Jun-nan，Luo Li，et al.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular[J].Journal of Forestry Research，2005，16（1）：61-64.
[5]陳和生，孫振亞.黑木耳多糖的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（5）：300-301.
[6]歐陽天贄，謝九皋.堿溶性黑木耳多糖分離、純化和表征[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18（1）：46-48.
[7]樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa級(jí)分的制備及其生物活性的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.
[8]李公斌. 黑木耳多 糖分子修飾 及功能與應(yīng)用研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2006.
[9]宋逍，張麗華，趙鵬，等.響應(yīng)面法優(yōu)選款冬花多糖的乙?；に囇芯縖J].中成藥，2013，35（9）：3030-2033.
[10]李敬，魏玉西，杜桂彩.鼠尾藻多酚的抗凝血活性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（3）：191-194.
[11]梁進(jìn)，張劍韻，崔瑩瑩.茶多糖的化學(xué)修飾及體外抗凝血作用研究[J].茶葉科學(xué)，2008，28（3）：166-171.
Study on derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular
ZHANG Zhi1，LIU Dong-min1，+，HU Jun-fei1，WANG Zhen-yu2，*，YU Zhen1
（1.Department of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Department of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）
Derivatization technology of polysaccharide from Auricularia auricular was optimized by using Response Surface Methodology，and examining the effect of anticoagulant in vitro after polysaccharide transforming as well.The results showed that selecting p-hydroxybenzoic acid as acyl donor，the best process condition of derivatization of conversion temperature of 55℃，the ratio of polysaccharide to acyl donor of 10∶1，polysaccharide concentration of 0.50mg/mL，that was the most effective condition.The optimal conversion rate was 27.26% under this condition.Conversion polysaccharide could improve the effect of anticoagulant in vitro.
Auricularia auricular polysaccharide；derivatization；response surface methodology；anticoagulant
TS201.1
B
1002-0306（2014）20-0263-06
10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.049
2014－01－15 +為并列第一作者
張智（1964-），女，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化。劉東敏（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。
* 通訊作者：王振宇（1957-），男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離與功能性食品開發(fā)。
猜你喜歡
中國洗滌用品工業(yè)(2017年2期)2017-04-16 05:07:45
當(dāng)代化工研究(2016年7期)2016-03-20 16:21:50
災(zāi)害醫(yī)學(xué)與救援(電子版)(2016年3期)2016-03-11 20:18:06
中國洗滌用品工業(yè)(2016年2期)2016-02-28 19:03:17
中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理(2015年3期)2016-01-14 03:41:43
西藏科技(2015年6期)2015-09-26 12:12:14
實(shí)用器官移植電子雜志(2015年1期)2015-04-02 14:58:26
鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)(2015年2期)2015-02-27 14:50:44
應(yīng)用化工(2014年5期)2014-08-08 13:10:58
