阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表達(dá)

劉 君，江連洲，高 博，鄧晨旭，陳璐璐，張 會，王多佳，李 杰，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)生物功能基因黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表達(dá)

劉 君1，2，江連洲3，高 博1，2，鄧晨旭1，2，陳璐璐1，2，張 會1，2，王多佳1，2，李 杰1，2，*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)生物功能基因黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

利用食品級黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)同源表達(dá)阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的有效途徑。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因（faeA）的編碼區(qū)，構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉。經(jīng)篩選獲得將faeA基因整合到糖化酶基因位點的同源重組轉(zhuǎn)化子4株。在酶搖瓶發(fā)酵條件下，重組菌株培養(yǎng)液上清中的阿魏酸酯酶活性最高達(dá)18.6mU/mL。SDS-PAGE分析顯示，4株重組菌株都有約36ku目的蛋白條帶，表達(dá)量為188～262μg/mL。結(jié)果表明，實現(xiàn)了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表達(dá)，為食品級阿魏酸酯酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

阿魏酸酯酶，黑曲霉，同源重組，表達(dá)

阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，F(xiàn)AE）又稱為肉桂酸酯酶，是指能夠水解低聚糖阿魏酸酯、阿魏酸甲酯和多糖阿魏酸酯酶中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的一種羧酸酯酶類[1-2]。阿魏酸酯酶可以切斷植物細(xì)胞壁中多糖與多糖、多糖與木質(zhì)素之間相交連的酯鍵，有利于植物細(xì)胞壁中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放[3-4]。同時阿魏酸酯酶還是一種能夠配合木聚糖酶等半纖維素酶類更好的降解植物細(xì)胞壁的酶制劑[5]。因此，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)[6]。

黑曲霉是一種公認(rèn)安全性的菌株，因其酶系豐富、代謝產(chǎn)物多而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，同時也是工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸酯酶的主要菌種。近年來，利用黑曲霉等絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白展現(xiàn)出巨大的潛力，被稱為“真核蛋白細(xì)胞工廠”[7]。盡管野生型黑曲霉能夠分泌阿魏酸酯酶，但是表達(dá)量低、發(fā)酵工藝復(fù)雜，不適合于規(guī)?；a(chǎn)。為了提高阿魏酸酯酶的產(chǎn)量，先前已經(jīng)有黑曲霉分泌的阿魏酸酯酶A在畢赤酵母中的表達(dá)的報道[8]，但是關(guān)于阿魏酸酯酶A在黑曲霉中高效表達(dá)的研究還較為有限。本研究擬在強(qiáng)誘導(dǎo)性啟動子glaA的調(diào)控下，實現(xiàn)阿魏酸酯酶在黑曲霉中的高效分泌表達(dá)，為培育食品級阿魏酸酯酶工程菌株，簡化阿魏酸酯酶的發(fā)酵條件，增加阿魏酸酯酶的產(chǎn)量探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉 由肇東市日成酶制劑有限公司提供；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌AGL1、質(zhì)粒pSZHG 由本實驗 室 構(gòu) 建 并 保 存 ；Primer STAR DNA Polymerase、dNTPs、Taq酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、XhoⅠ、ApaⅠ、ClaⅠ、pMD18-T載體、T4 DNA Ligase 購于TaKaRa公司；DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 均購于天根公司；PCR引物、基因測序 由北京華大基因公 司 完 成 ；利 福 霉 素（Rif）、卡 那 霉 素（Kan）、乙 酰 丁香酮（AS） 購于上海生物工程有限公司；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

暗箱式紫外紫外透射儀 上海顧村電光儀器廠；PH320型酸度計 梅特勒-托利多有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器廠；高速離心機(jī) 德國 Thermo Fisher Scientific ；凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 德 國AlphalmagerR EC；超凈工作臺 蘇凈凈化儀器廠；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng) 美國伯樂公司；PCR儀 比朗實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉基因組的提取 采用CTAB法提取黑曲霉基因組[9]。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)Genebank中公布的黑曲霉阿魏酸酯酶基因faeA序列（序列號：AF361950.1），以及黑曲霉表達(dá)載體pSZHG多克隆位點的特征，用Primer 5.0軟件分別設(shè)計faeA基因引物P1、P2。根據(jù)黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA的序列，以及黑曲霉糖化酶基因位點的序列設(shè)計轉(zhuǎn)化子PCR檢測引物P3、P4及同源重組轉(zhuǎn)化子PCR檢測引物P5、P6。引物序列如表1所示。

1.2.3 基因擴(kuò)增 以黑曲霉基因組為模板，利用P1、P2引物，PCR擴(kuò)增出阿魏酸酯酶faeA基因片段。將PCR擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物加A回收，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落，提取質(zhì)粒酶切鑒定，將酶切鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送交測序公司測序，得到測序結(jié)果后進(jìn)行Blast比對，并分析序列信息。

1.2.4 黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA的構(gòu)建 用ApaⅠ和ClaⅠ雙酶切鑒定正確的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，得到903bp的目的帶，再用相同的酶，酶切表達(dá)載體pSZHG，回收大約為15280bp大小的目的條帶。將這兩條具有粘性末端的片段利用T4DNA Ligase連接，構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA（圖1）。

圖1 黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA的構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of expression vector pSZHG-faeA

1.2.5 黑曲霉的轉(zhuǎn)化及同源重組菌株的篩選 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉，利用PCR鑒定法篩選同源重組菌株[10]。

1.2.6 重組菌株酶活測定 取搖瓶發(fā)酵的阿魏酸酯酶發(fā)酵液上清液，采用去淀粉麥麩法對其進(jìn)行酶活測 定[11]。 阿 魏 酸 酯 酶 酶 活 單 位 定 義 為 ：在 反 應(yīng) 條 件下，每分鐘降解底物生成1μmol阿魏酸所需要的酶量為一個酶活單位。

2 結(jié)果與分析

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this research

2.1 阿魏酸酯酶faeA基因的擴(kuò)增

以黑曲霉基因組DNA為模板，利用P1、P2引物擴(kuò)增出大小為903bp的目的片段。將此片段測序、進(jìn)行blast比 對 ，結(jié) 果 表 明 ，克 隆 的 faeA基 因 與 登 錄 號AF361950.1基因序列相似性為100%。

2.2 阿魏酸酯酶基因黑曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建

用ApaⅠ和ClaⅠ雙酶切質(zhì)粒pSZHG-faeA，可切出 903bp 大 小 的 faeA 基 因 片 段 和 15280bp 左 右 的pSZHG載體片段，說明載體構(gòu)建正確。

圖2 faeA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Result of faeA gene PCR

圖3 pSZHG-faeA表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Result of enzyme identification expression vector pSZHG-faeA

2.3 黑曲霉轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

將農(nóng)桿菌與黑曲霉在篩選培養(yǎng)基上共培養(yǎng)6～8d，可見明顯生長的黑曲霉菌落，挑取篩選平板上的單菌落于液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至長出菌絲體，提取黑曲霉菌絲體基因組DNA，利用P3、P4引物，結(jié)果篩選出4株陽性轉(zhuǎn)化子。

圖4 pSZHG-faeA重組轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Results of identification pSZHG-faeA recombination transformants by PCR

2.4 同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

對篩選出的4株陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同源重組篩選，利用P5、P6引物對其進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果4株轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出1701bp的目的帶，可知均為同源重組轉(zhuǎn)化子，同源重組轉(zhuǎn)化率為100%。

圖5 同源重組轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Results of PCR of homologous recombination transformants

2.5 重組阿魏酸酯酶酶活的測定

利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)阿魏酸酯酶重組菌株，從第4d開始取樣，連續(xù)取樣6d，離心取發(fā)酵液上清液，進(jìn)行酶活測定，酶活測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液上清液中的阿魏酸酯酶酶活Fig.6 Enzyme activity detection at different time of faeA

2.6 重組阿魏酸酯酶的蛋白檢測

取第5d發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖7所示。與出發(fā)菌株相比，4株重組菌株都在約36ku的位置出現(xiàn)了明顯的目的蛋白條帶。經(jīng)ALPHAIMAGER SYSTEMS軟件分析，4株重組菌株的目的蛋白表達(dá)量為188～262μg/mL，而出發(fā)菌株僅為34μg/mL。

圖7 SDS-PAGE 蛋白表達(dá)凝膠電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE expressed protein polyacrylamide gel electrophoresis

3 結(jié)論與討論

當(dāng)今食品安全問題得到人們越來越多的重視，黑曲霉作為一種世界公認(rèn)的安全生產(chǎn)菌株其優(yōu)良的蛋白質(zhì)分泌能力、高效準(zhǔn)確的翻譯后加工、與高等真核生物類似等優(yōu)點被廣泛用于工業(yè)酶制劑加工受體菌中。本研究利用酶切連接的方法將阿魏酸酯酶faeA基因與黑曲霉載體pSZHG成功連接，構(gòu)建成阿魏酸酯酶黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA，實現(xiàn)了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表達(dá)。本實驗所用黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-faeA中潮霉素抗性基因兩端設(shè)計有順向重復(fù)的3’GLA序列，可通過這兩個3’GLA之間的同源重組進(jìn)一步刪除hph基因，以獲得符合食品級生產(chǎn)要求的工程菌[10]。

本研究實現(xiàn)了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表達(dá)，獲得的4株重組菌株的目的蛋白表達(dá)量達(dá)到188～262μg/mL，表達(dá)量較高，這為今后阿魏酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)ALPHAIMAGER SYSTEMS軟件分析SDS-PAGE中目的蛋白的分子量約為36ku，比阿魏酸酯酶理論分子量30.5ku稍大。通過NetNGlyc 1.0 Server軟件分析發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶氨基酸序列中有一個糖基化位點，可能是該位點的糖基化導(dǎo)致重組蛋白的實際分子量高于理論值。

本實驗利用去淀粉麥麩法測定不同培養(yǎng)時間的重組阿魏酸酯酶發(fā)酵液上清液酶活，酶活最高達(dá)18.6mU/mL，這 與 國 內(nèi) 歐 仕 益 等[12]的 研 究 結(jié) 果（泡 盛曲霉固態(tài)發(fā)酵阿魏酸酯酶酶活為0.0679U/g）尚有一定差距。這可能是因為在麥麩和玉米渣的培養(yǎng)基中更有利于曲霉分泌阿魏酸酯酶。其次本研究克隆得到的阿魏酸酯酶基因序列雖與登錄號AF361950.1相似 性 為 100% ，但 是 與 國 外 David Navarro 等[13]報 道的阿魏酸酯酶酶活表達(dá)較高的基因序列Y09330相比（阿魏酸酯酶表達(dá)量達(dá)1.4～1.5g/L）有兩處氨基酸發(fā)生改變，分別是第224位的天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?，?25位的谷氨酸變?yōu)樘於０罚ㄟ^分析這2個位點都不在阿魏酸酯酶的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這2個位點的改變對阿魏酸酯酶酶活的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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Homologous expression of ferulic acid esterase in Aspergillus niger

LIU Jun1，2，JIANG Lian-zhou3，GAO Bo1，2，DENG Chen-xu1，2，CHEN Lu-lu1，2，ZHANG Hui1，2，WANG Duo-jia1，2，LI Jie1，2，*
（1.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Agricultural Biological Gene Functional Gene of Key Larboratory of Colleges and University Heilongjiang Province，Harbin 150030，China；3.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

By using of food-grade Aspergillus niger expression system expressed ferulic acid esterase was an efficient path which could increase production of ferulic acid esterase and reduce production cost.Ferulic acid esterase （faeA） coding region in Aspergillus niger was cloned by the method of PCR，constructed Aspergillus niger expression vector pSZHG-faeA and transformed Aspergillus niger in the use of agrobacterium-mediated method.In the end ， 4 positive homologous transformants were screened out， which the faeA gene was integrated into the glucoamylase gene locus.Engineering strain showed that glucoamylase fermentation condition of the engineering strain culture supernatant activity up to 18.6mU/mL.SDS-PAGE analysis showed that the 4 recombination strains were obviously different from starting strain，had about 36ku interest protein band.The protein expression quality was 188 ～262μg/mL.The result indicated that this reserch realized homologous expression of ferulic acid esterase in Aspergillus niger.This research laid the foundation for mass industrial production of food-grade ferulic acid esterase.

ferulic acid esterase；Aspergillus niger；homologous recombination；expression

Q786

A

1002-0306（2014）20-0200-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.035

2014－02－24

劉君（1988-），女，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)與基因工程。

* 通訊作者：李杰（1972-），男，博士，教授，研究方向：分子遺傳學(xué)與基因工程。

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2013AA102104）。