香菇纖維素衍生物抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒的研究

李紅波，王淼焱，胡梁斌，*，莫海珍，潘道東

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211）

（2.河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

香菇纖維素衍生物抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒的研究

李紅波1，2，王淼焱2，胡梁斌2，*，莫海珍2，潘道東1

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211）

（2.河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

黃曲霉毒素具有誘導突變、抑制免疫和致癌作用?？刂泣S曲霉毒素污染一直是世界性難題，也是近年來的研究熱點之一。實驗研究了香菇纖維素衍生物GPX抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒活性，初步探究了GPX抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒的作用機制。 結果表明，10、50μg/mL的GPX對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率分別達到70%、95%，而100、250、500、750、1000μg/mL的GPX對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率均可達到100%，抑制活性極其明顯。GPX離體抗氧化能力很低，但是能夠緩解黃曲霉菌絲的氧化脅迫。此外GPX促進了黃曲霉細胞內(nèi)囊泡過早與大液泡的融合，該現(xiàn)象能夠抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。

黃曲霉毒素B1，香菇，纖維素，抑制作用

黃曲霉菌（Aspergillus flavus）產(chǎn)生的黃曲霉毒素（aflatoxin）是目前發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強的化學物質(zhì)之一，被國際癌癥研究所確定為一級人類致癌物。黃曲霉毒素通過原料、糧食產(chǎn)品的加工儲藏，以及污染動物飼料等環(huán)節(jié)污染糧源性食品、食用油類以及畜禽類產(chǎn)品[1]。鑒于黃曲霉毒素污染給我國造成的重大經(jīng)濟損失以及對人們健康的威脅，科研人員一直在尋求能控制黃曲霉毒素污染的有效策略。

Reverberi等 報 道 香 菇（Lentinus edodes）中 的 多糖提取物能夠抑制寄生曲霉（A.parasiticus）產(chǎn)生黃曲霉毒素。研究表明很可能是多糖提取物中的β-葡聚糖激活了與氧化脅迫反應相關的轉(zhuǎn)錄因子hsf-2，并且延遲了黃曲霉毒素產(chǎn)生相關基因aflR和norA的轉(zhuǎn)錄[2]。Zjalic等發(fā)現(xiàn)白腐菌（Trametes versicoior）產(chǎn)生的β-葡聚糖也能夠抑制黃曲霉毒素的合成，再次展現(xiàn) 了 β-葡 聚 糖 在 黃 曲 霉 毒 素 控 制 中 的 應 用 前 景[3]。2009年，美國學者Chanda等提出了黃曲霉毒素黃曲霉亞細胞區(qū)域化、毒素基因表達、碳源途徑的調(diào)控模型[4]，隨后提出了囊泡化合成釋放毒素的理論模型，揭示了囊泡和大液泡在黃曲霉毒素合成、轉(zhuǎn)運、輸出等過程中的重要作用機制[5]。

在之前的研究中我們篩選了香菇多糖、海帶多糖、石耳素等十余種多糖對黃曲霉生長及產(chǎn)毒的抑制作用[6]。其中發(fā)現(xiàn)香菇纖維素雖與花生殼纖維素結構相似，但香菇纖維素能夠顯著抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生，而花生殼纖維素一定程度上能夠促進黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒。通過深入研究，我們發(fā)現(xiàn)了香菇纖維素的一種衍生物有著超強的抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒活性。通過鑒定發(fā)現(xiàn)，該衍生物為單一組分的β-葡聚糖，我們將該物質(zhì)命名為GPX（glycoprotein-x）。本文研究了黃曲霉菌經(jīng)過GPX處理后，菌絲體的氧化系統(tǒng)活性變化和囊泡化現(xiàn)象，觀察了GPX與黃曲霉菌膜的結合情況，初步探究了GPX抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒的作用機制，為控制黃曲霉毒素多糖制劑的研發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉菌CGMCC3.2890 購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，PDA培養(yǎng)基4℃保存；沙氏液體培養(yǎng)基（蛋白胨1g，葡萄糖4g，蒸餾水100mL，自然pH，高壓121℃滅菌15min），乙腈、單糖標準品 購于上?；瘜W試劑公司；黃曲霉毒素B1購于美國Sigma-Aldrich公司。

DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀 北京市六一儀器廠；80i型高級多功能研究型生物顯微鏡 日本尼康公司；Quanta200型掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床 上海通特電訊設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 GPX提取及基本組成分析 取一定量的干香菇，粉碎，粉末水洗3～4次后擠干水分，按料液比1∶10～1∶13g/mL加入稀硫酸溶液，料液pH為1.5，于（85±5）℃下浸提1.5～2.0h，趁熱過濾，熱水洗滌濾渣。濾渣水洗至中性，用5%的H2O2漂白，干燥、打粉、過篩獲得香菇水不溶性纖維素[7]。稱取香菇水不溶性纖維素按水∶纖維素=100∶1放于三角瓶中，高壓鍋內(nèi)121℃處理15min，趁熱過濾，濾液冷凍干燥得GPX固體粉末。采用Sepharose CL-6B凝膠層析柱（1.6cm×100cm）進行柱層析測定純度。用磷酸鹽緩沖液（25℃、pH7.0）平衡，直至流出的液體的pH達到7.0，方可加樣品。樣品稀釋至1%，上樣量約為2mL，加樣后用超純水洗脫，收集器中每管約8mL，流速約為32mL/h，每次收集約60管。用苯酚硫酸法（490nm）測多糖，以考馬斯亮藍法（595nm）測定蛋白含量。最后以洗脫管數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。

1.2.2 抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒活性測定 將20mL沙氏培養(yǎng)基倒入50mL三角瓶中，向培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的GPX溶液1mL，使得GPX濃度最終分別為0、10、50、100、250、500、750、1000μg/mL，滅菌后，每瓶分 別 加 入 預 先 稀 釋 到 1 ×106CFU/mL的 孢 子 懸 浮 液100μL，置于30℃、120r/min恒速搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)60h后測定AFB1產(chǎn)量，計算毒素抑制率。抑制率（%）=（1-處理組毒素/對照組毒素）×100。

1.2.3 AFB1提取及含量測定 吸取一定量黃曲霉培養(yǎng)濾液，加三倍氯仿萃取，萃取液于60℃用氮吹儀吹干，溶解在甲醇中，過0.22μm微孔濾膜，然后用HPLC測定。色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column（4.6mm I.D.×250mm）（上海泉島公司）；柱溫：22℃；進樣量：10μL；檢測波長：365nm；流動相：乙腈∶甲醇∶水（1∶1∶2，v/v/v）；流速：1mL/min[8]。

1.2.4 GPX處理后黃曲霉氧化系統(tǒng)酶活性測定

1.2.4.1 SOD活性測定[9]分別添加5、50μg/mL GPX對黃曲霉進行處理，培養(yǎng)48h對照組未產(chǎn)毒前，分別采樣。稱取黃曲霉菌絲體0.3g加入到1.5mL預冷的酶提取液中，研磨勻漿，10000g，4℃離心20min。上清液用于SOD酶的活性測定。酶提取液各成分為50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.0），0.2mmol/L EDTA，1.0%（w/v）PVP，0.1%TritonX-100。采用NBT（氯化硝基四氮唑蘭）光還原法。吸取2.4mL 50mmol/L pH7.8磷酸緩沖液，加入0.2mL 195mmol/L硫氨酸，0.1mL 3μmol/L EDTA，0.2mL 1.125mmol/L NBT，0.1mL核 黃 素 60μmol/L，最后加入0.1mL粗酶液。加完1號管避光，其他管置于4000Lx日光燈下準確反應10min，25℃，反應結束后所有管用黑布遮蓋以終止反應，避光管為對照，在波長560nm測定OD值。以每毫克蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位。

1.2.4.2 CAT活性測定[10]配制0.3%H2O2溶液作為底物溶液：吸5mL 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸緩沖溶液（PBS）定容到500mL。 反應體系包含1mL 0.3%H2O2溶 液 、1.9mL H2O、0.1mL 酶 液 ，測 定OD240nm降低速度。將每毫克蛋白每分鐘OD減少0.01定義為1個活力單位。

1.2.4.3 H2O2測定 使用100μg/mL GPX處理過的黃曲霉及對照組經(jīng)過12、24、48h、72h的培養(yǎng)，分別采樣。稱取約0.1g的黃曲霉菌絲，置于1.5mL含1mmol/L鹽酸羥胺的磷酸鹽緩沖液中。10，000g離心10min，0.5mL上清液與1.5mL含0.1%TiCl4的20%H2SO4充分混合后，10，000g離心10min，在410nm處測定上清液吸光度值[9]。H2O2的消光系數(shù)采用0.28L·mol-1·cm-1。

1.2.4.4 脂質(zhì)過氧化分析[11]MDA的濃度可作為黃曲霉細胞脂質(zhì)過氧化指標。使用100μg/mL GPX處理過的黃曲霉及對照組經(jīng)過12、24、48、72h的培養(yǎng)，分別采樣。在8000×g離心10min收集樣液中藻細胞，然后在2mL含有10%三氯乙酸中均質(zhì)。勻漿在8000×g離心10min，吸取2mL的上清液，與2mL的TBA溶液混合。混合液在95℃加熱30min，然后迅速冷卻。隨后在5000×g離心10min，上清液在532nm測其吸光度，在600nm糾正非特異吸光度。MDA含量計算依據(jù)公式：C=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

1.2.5 GPX造成黃曲霉細胞液泡化研究 沙氏培養(yǎng)基 添 加100μg/L GPX，接 種 黃 曲 霉 孢 子 液 ，設 置 對照組，30℃，120r/min培養(yǎng)60h后，對照組黃曲霉產(chǎn)毒，處理組沒有毒素產(chǎn)生，分別挑取菌絲在顯微鏡下觀察。

1.2.6 GPX與細胞膜結合實驗 取正常培養(yǎng)未產(chǎn)毒的黃曲霉菌絲，濾紙吸干，用100μg/mL GPX處理，之后過濾，用蒸餾水沖洗3次，濾紙吸干，取處理后菌絲與未處理菌絲分別用環(huán)境掃描電鏡進行觀測。

2 結果與分析

2.1 GPX基本組成分析

經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)GPX主要含多糖和蛋白質(zhì)，含量分別為82%和18%。經(jīng)過凝膠柱分離，采用考馬斯亮藍法和苯酚硫酸法分別測定吸光度值，得到單一峰形（見圖1）。而且多糖峰和蛋白峰基本重合，由此推測GPX很有可能為一種糖蛋白組分，為單一的香菇纖維素衍生物，純度較高。

圖1 GPX凝膠柱譜圖Fig.1 Gel column chromatogram of GPX

2.2 GPX抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒活性測定

不同濃度的GPX加入到培養(yǎng)基中，接種黃曲霉60h，分別測定黃曲霉毒素含量。與對照組相比，10、50μg/mL GPX 對 黃 曲 霉 菌 產(chǎn) 毒 的 抑 制 率 分 別 達 到70%、95%，而 100、250、500、750、1000 μg/mL 的GPX對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率均達到100%（見圖2），抑制活性極顯著。

圖2 不同濃度的GPX對黃曲霉產(chǎn)毒的抑制率Fig.2 Inhibition of aflatoxin production by GPX at different concentrations

2.3 GPX處理后黃曲霉氧化系統(tǒng)酶活性分析

2.3.1 SOD、CAT酶活性測定 SOD、CAT等組成機體清除ROS的保護酶系統(tǒng)。SOD是清除自由基的關鍵抗氧化酶之一，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用；而CAT則能清除H2O2。如圖3所示，分別 用5、50μg/mL GPX對 黃 曲 霉 進 行 處 理48h后 ，對SOD、CAT同工酶活性測定發(fā)現(xiàn)隨著GPX處理濃度的增高，SOD、CAT活性也有一定程度的升高。

2.3.2 黃曲霉H2O2與脂質(zhì)過氧化分析 有研究表明多糖能夠緩解黃曲霉毒素對肝臟細胞的毒害，其機制與 抑 制 活 性 氧 的 形 成 緩 解 細 胞 的 氧 化 脅 迫 有 關[12]。黃曲霉菌體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)被證實與產(chǎn)毒密切相關[13]。GPX是一種多糖，我們研究發(fā)現(xiàn)其并不具有良好的抗氧化能力。H2O2是黃曲霉內(nèi)主要的ROS之一，丙二醛（MDA）含量的高低代表機體遭受氧化脅迫的程度。由圖4可知，與對照組相比，GPX處理過的黃曲霉經(jīng)過12、24、48h的培養(yǎng)后，H2O2和MDA值均有不同程度的下降，可見GPX處理能夠激活抗氧化系統(tǒng)，緩解黃曲霉菌的氧化脅迫狀態(tài)。

圖3 5、50μg/mL GPX處理后，對黃曲霉CAT、SOD活性的影響Fig.3 Effects of the treatment with 5μg/mL and 50μg/mL GPX on the activities of CAT and SOD in A.flavus

圖4 GPX處理對黃曲霉體內(nèi)H2O2水平和MDA水平的影響Fig.4 Effects of the treatment with GPX on the levels of H2O2and MDA in A.flavus

2.4 GPX造成黃曲霉細胞液泡化研究

研究表明黃曲霉毒素合成最后幾步是在囊泡（vesicle）里完成的，然后通過囊泡運輸?shù)桨?，通過胞吐作用釋放毒素[5]。囊泡融合成液泡，會導致合成酶發(fā)生降解，不利于毒素的合成。50μg/mL GPX處理48h后的黃曲霉菌絲在顯微鏡下觀察，如圖5所示，黃曲霉菌細胞內(nèi)液泡化嚴重，而對照組菌絲細胞內(nèi)幾乎沒有大液泡形成。囊泡被大液泡吞噬合并后，黃曲霉毒素合成轉(zhuǎn)運、釋放均受到阻礙。GPX很可能是促進了黃曲霉細胞內(nèi)囊泡過早與大液泡的融合，從而抑制了黃曲霉毒素的產(chǎn)生。大液泡的形成與VeA蛋白復合體密切相關，而該復合體還參與了毒素合成相關基因的調(diào)控，因此GPX對黃曲霉產(chǎn)毒的抑制應該是多元化的。

圖5 GPX處理導致的黃曲霉菌絲囊泡化（1000×）Fig.5 Vacuole formation in the mycelia of A.flavus exposed to GPX

2.5 GPX在菌絲表面的聚合

由圖6可見，GPX可以在黃曲霉菌絲表面發(fā)生聚合，并形成了一種網(wǎng)狀包被結構。由于GPX分子量較大，難以透過細胞膜進入黃曲霉細胞內(nèi)部引起代謝調(diào)控，更有可能的是黃曲霉菌膜表面存在GPX結合受體，通過受體介導了黃曲霉毒素的代謝。已有研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌絲膜上存在GPCR（G蛋白偶聯(lián)受體），能夠識別不同碳源，與黃曲霉產(chǎn)毒密切相關[14]，GPX是否是通過與GPCR互作抑制黃曲霉產(chǎn)毒有待于進一步的研究。

圖6 通過掃描電鏡觀察GPX在黃曲霉菌絲表面的聚合（4000×）Fig.6 Aggregation of GPX on the surface of mycelia of A.flavus under the scanning electronic microscope（4000×）

3 結論

研究表明，香菇纖維素的衍生物（GPX）具有很強的抑毒活性，10、50μg/mL的GPX對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率分別達到70%、95%，而100、250、500、750、1000μg/mL的GPX對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率均達到100%，可以用來作為食品或者飼料的添加劑控制黃曲霉毒素污染。GPX能夠緩解黃曲霉菌絲的氧化脅迫，同時可以促進黃曲霉細胞內(nèi)囊泡過早與大液泡的融合，為控制黃曲霉毒素污染的多糖制劑的研發(fā)提供了理論基礎。

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Study on mushrooms vellulose ferivatives inhibiting aflatoxin production by Aspergillus flavus

LI Hong-bo1，2，WANG Miao-yan2，HU Liang-bin2，*，MO Hai-zhen2，PAN Dao-dong1
（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）2.College of Food Science，Henan Institute of Science&Technology，Xinxiang 453003，China）

Aflatoxin is well known with considerable adverse effects including the induction of genetic mutation ，liver cancer and the suppression of the immune system on human and animal.Control of aflatoxin contamination is a worldwide problem.Mechanism involved in the aflatoxin-production inhibition by Lentinus edodes cellulose derivatives GPX was investigated.The results showed that inhibition rates of toxin production by 10 and 50μg/mL of the GPX were 70%and 95%，respectively.More GPX （100，250，500，750，1000μg/mL） gave the rise to complete inhibition of toxin production.Without high antioxidant activity in vitro，GPX could modify oxidative stress in A.flavus.In addation，GPX was found to promote premature fusion of vesicles and formation of vacuole in A.flavus，which was proved association with the inhibition of aflatoxin production.

aflatoxin B1；Lentinus edodes；cellulose；inhibition

TS201

A

1002-0306（2014）20-0174-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.029

2014－03－11

李紅波（1987-），男，博士，研究方向：黃曲霉毒素代謝及控制。

* 通訊作者：胡梁斌（1979-），男，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物活性方面的研究。

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101231）。