余盼攀,張啟瑜,金慧成
(1.杭州市第一人民醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310000;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江溫州 325015)
白細(xì)胞介素17對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原代謝的影響
余盼攀1,張啟瑜2,金慧成1
(1.杭州市第一人民醫(yī)院 普外科,浙江 杭州 310000;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科,浙江溫州 325015)
目的:探討白細(xì)胞介素17(IL-17)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)的影響及其與肝纖維化的關(guān)系。方法:采用Optiprep密度梯度離心法分離HSCs并進(jìn)行鑒定、傳代。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測IL-17作用HSCs 72 h后α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響。采用MTT法檢測IL-17作用HSCs 24、48和72 h后細(xì)胞的增殖情況。采用RT-PCR法和ELISA法分別檢測IL-17作用HSCs后MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:成功分離并培養(yǎng)HSCs,一定濃度的IL-17能促進(jìn)HSCs α-SMA的表達(dá)并且促進(jìn)HSCs增殖。IL-17能提高HSCs MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的分泌,呈濃度依賴性,且TIMP-1/MMP-9比值隨IL-17濃度增加而遞增。結(jié)論:IL-17不僅促進(jìn)HSCs增殖,還能促進(jìn)α-SMA、MMP-9和TIMP-1的表達(dá),同時(shí)提高TIMP-1與MMP-9的比值,可能在肝纖維化中扮演重要角色。
白細(xì)胞介素17;肝星狀細(xì)胞;α肌白蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1;大鼠
肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)主要位于肝竇周圍間隙內(nèi),在生理情況下參與體內(nèi)維生素A的代謝。HSCs的活化、增殖、凋亡及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)與肝纖維化的關(guān)系目前已經(jīng)形成共識(shí)[1]。ECM的動(dòng)態(tài)平衡主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)調(diào)節(jié)。而白細(xì)胞介素(IL-17)是由新型Th17細(xì)胞分泌的一種炎癥因子,是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子之一。研究顯示,IL-17與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[2-5],但具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察IL-17對(duì)HSCs的增殖及膠原代謝的影響,進(jìn)一步闡述IL-17與肝纖維化的關(guān)系。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年雄性SD大鼠10只(溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),無特定病原菌級(jí),體質(zhì)量200~250 g,普通喂養(yǎng),自由進(jìn)食。
1.1.2 主要試劑:IV型膠原酶、DNA酶I均購自美國Sigma公司。Optiprep分離介質(zhì)購自挪威Axisshield公司。大鼠α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德公司。鼠源重組IL-17購自英國PeproTech公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。四甲偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio北京公司。大鼠MMP-9和TIMP-1 ELISA試劑盒購自美國R&D公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol試劑盒均購自美國invitrogen公司。大鼠MMP-9和TIMP-1和內(nèi)參GAPDH PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.1.3 主要儀器:超凈工作臺(tái)(蘇州凈化),PCR儀(德國Biometra公司),紫外分光光度計(jì)(美國Beckman公司),相差顯微鏡(日本Olympus公司),高速離心機(jī)(美國Beckman公司),CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司),恒溫水浴箱(丹麥Heto公司),熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞分離及分組:采用改良的Optiprep密度梯度法[6]分離大鼠HSCs。將細(xì)胞以5×105/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞。以后每2~3 d換液1次,待細(xì)胞長滿瓶底時(shí)0.25%胰酶消化傳代。將細(xì)胞分為5個(gè)處理組:對(duì)照組、1 ng/mL IL-17組、10 ng/mL IL-17組、100 ng/mL IL-17組、500 ng/ mL IL-17組。
1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HSCs、α-SMA表達(dá):將對(duì)數(shù)生長期的HSCs以每孔3×104/mL接種入6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片,并加入IL-l7(100 ng/mL)進(jìn)行處理,對(duì)照組加入等量0.9%氯化鈉溶液,培養(yǎng)72 h后取出進(jìn)行染色,PBS沖洗3次后4%多聚甲醛固定15 min,3% Triton X-100透膜30 min,封閉,滴加一抗(4 ℃過夜),PBS沖洗,滴加二抗孵育30 min,DAB試劑盒進(jìn)行顯色,蘇木素染色2 min,依次在75%、85%、95%、100%乙醇中脫水,封片觀察。
1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況:將對(duì)數(shù)生長期的HSCs以每孔3×103/mL細(xì)胞接種入96孔板中,培養(yǎng)24 h,換無血清的DMEN饑餓過夜使細(xì)胞同步化。按照上述分組進(jìn)行處理,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后棄上清,每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT 20μL,37 ℃作用4 h后棄作用液,各孔加入DMSO 150μL,震蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm波長檢測各孔吸光度(OD)。
1.2.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞MMP-9和TIMP-1mRNA表達(dá)水平:取對(duì)數(shù)生長期HSCs,按1×105/mL細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng),按照上述分組處理,培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于總RNA提取,RNA提取采用Trizol法。取等量的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增:引物序列GAPDH引物上游5’-GTGCGATGGCGTGCTATG-3’,下游5’-GGGTGG TCCAGGGTTTCTTA-3’,片段長度280 bp;TIMP-1引物上游5’-TCCTCTTGTTGCTATCATTGATAGCTT-3’,下游5’-CGCTGGTATAAGGTGGTCTCGAT-3’,片段長度148 bp;MMP-9引物上游5’-CAGTGTAGGCGTGGGTCCAGTA-3’,下游5’-CCAAGAACTTCCGACTATCCAATGA-3’,片段長度110 bp。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)30~35次。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,利用Gel-Pro分析軟件分析條帶。
1.2.5 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清MMP-9和TIMP-1蛋白量:HSCs以3×105/mL接種于24孔板中,待細(xì)胞貼壁并同步化后按上述分組處理細(xì)胞24 h終止培養(yǎng),取細(xì)胞培養(yǎng)液離心去除沉淀,取上清,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,操作結(jié)束后將ELISA板置于酶標(biāo)儀上450 nm波長下讀取各孔吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MMP-9和TIMP-1的含量。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)據(jù)用±s表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 HSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 采用Optiprep密度梯度離心法分離HSCs,平均細(xì)胞得率2×107個(gè)/肝。經(jīng)0.4%錐蟲藍(lán)染色,細(xì)胞存活率在90%以上。熒光顯微鏡下新分離的細(xì)胞自發(fā)淡藍(lán)色熒光,見圖1。相差顯微鏡下,新分離的HSCs呈圓形,具有很強(qiáng)的折光性,體積明顯小于肝細(xì)胞,培養(yǎng)至5 d左右細(xì)胞外觀呈現(xiàn)出明顯的梭形,胞漿內(nèi)顆粒減少,細(xì)胞逐漸融合成片狀生長,見圖2。
圖1 新分離HSCs自發(fā)熒光(×400)圖2 相差顯微鏡下培養(yǎng)5 d的HSCs(×200)
2.2 IL-17促進(jìn)HSCs α-SMA的表達(dá) IL-17作用體外培養(yǎng)5 d的HSCs 72 h,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測定α-SMA在HSCs中表達(dá)情況,可見陽性染色的α-SMA位于胞質(zhì)內(nèi),呈高張力纖維狀分布,IL-17(100 ng/ mL)處理組比空白對(duì)照組HSCs α-SMA的表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果見圖3。
2.3 IL-17促進(jìn)HSCs增殖 MTT結(jié)果顯示,在一定時(shí)間和濃度下,IL-17具有促進(jìn)HSCs增殖的作用。IL-17作用HSCs 24 h后,隨藥物濃度的增高,細(xì)胞的增殖有增高的趨勢,但各濃度組與對(duì)照組比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)作用48、72 h,藥物濃度在10、100和500 ng/mL時(shí),隨著作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加,增殖作用越顯著,各組與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。IL-17作用HSCs 72 h,100 ng/mL與500 ng/mL組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明在作用72 h后IL-17促HSCs增殖作用可能在100 ng/mL時(shí)基本達(dá)到飽和,見表1。
圖3 培養(yǎng)5 d HSCs α-SMA免疫染色(×400)
表1 不同濃度IL-17作用HSCs不同時(shí)間細(xì)胞增殖OD值(n=6,±s)
表1 不同濃度IL-17作用HSCs不同時(shí)間細(xì)胞增殖OD值(n=6,±s)
組別24 h48 h72 h 10.304±0.0280.367±0.0300.671±0.027 20.307±0.0270.372±0.0320.717±0.048 30.321±0.0130.411±0.024a0.765±0.037a40.324±0.0120.500±0.018a0.853±0.038a50.326±0.0290.524±0.017a0.871±0.046a注:1:對(duì)照組;2:1 ng/mL IL-17組;3:10 ng/mL IL-17組;4:100 ng/ mL IL-17組;5:500 ng/mL IL-17組。與對(duì)照組比:aP<0.01
2.4 IL-17促進(jìn)HSCs MMP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示,IL-17作用于HSCs 24 h能明顯促進(jìn)MMP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá),除1 ng/mL組外,其余各濃度組與對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并且呈濃度依賴性。如圖4-5可知,TIMP-1 mRNA表達(dá)量明顯強(qiáng)于MMP-9 mRNA表達(dá)量,且TIMP-1/ MMP-9 mRNA比值隨濃度增加而遞增,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖4 不同濃度IL-17對(duì)HSCs MMP-9 mRNA表達(dá)的影響
圖5 不同濃度IL-17對(duì)HSCs TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響
2.5 IL-17對(duì)HSCs分泌MMP-9和TIMP-1蛋白的影響如表2所示,IL-17能明顯促進(jìn)HSCs MMP-9、TIMP-1蛋白的分泌,除1 ng/mL組外,其余各濃度組與對(duì)照組比均明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并且隨著作用濃度的提高,MMP-9和TIMP-1蛋白量也逐漸提高,呈濃度依賴性。下表可知TIMP-1蛋白含量明顯高于MMP-9,TIMP-1/MMP-9比值隨濃度增加而遞增,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。
表2 不同濃度IL-17作用大鼠HSCs后MMP-9和TIMP-1蛋白水平(n=6,±s)
肝纖維化是一個(gè)慢性的病理過程,是肝硬化的中間環(huán)節(jié),是一種可逆的損傷-修復(fù)反應(yīng)[7]。雖然多種因素能夠引起肝纖維化,但HSCs的激活、增殖及分泌ECM仍然是肝纖維化形成的重要過程[8]。HSCs被激活后,轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞并特異性表達(dá)α-SMA,說明α-SMA是HSCs活化的標(biāo)志,也是提示肝纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一[9]。目前研究證實(shí),多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-6等都能經(jīng)過多種途徑促進(jìn)HSCs的活化、增殖及膠原合成,從而引起肝纖維化[10]。MMPs是調(diào)節(jié)ECM動(dòng)態(tài)平衡的重要酶系,TIMPs是一種能抑制MMPs功能的活性多肽[11]。在肝組織中MMPs和TIMPs主要由活化的HSCs產(chǎn)生。由于肝臟ECM代謝主要由MMPs和TIMPs共同調(diào)節(jié),目前觀點(diǎn)認(rèn)為MMPs和TIMPs的失衡也是肝纖維化形成的重要因素[12]。MMP-9是一種明膠酶B。有研究表明,在肝纖維化早期MMP-9的基因表達(dá)顯著增強(qiáng),但在肝硬化期表達(dá)量則呈下降趨勢,說明MMP-9對(duì)肝硬化的發(fā)生發(fā)展具有雙重的調(diào)節(jié)作用。MMP-9不僅能降解異常沉積的ECM,還可降解由IV型膠原構(gòu)成的肝臟正常的基底膜及正常的肝組織,從而破壞HSCs與ECM間的動(dòng)態(tài)平衡,激活并促進(jìn)HSCs增殖。TIMP-1則不僅能抑制降解異常ECM的MMPs的活性,而且還可以抑制酶原的激活使ECM降解減少,兩者共同促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。
IL-17細(xì)胞因子家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)和IL-17F。通常我們研究的IL-17為IL-17A。IL-17是一類由CD4+ T細(xì)胞亞型—Th17細(xì)胞分泌的前炎癥因子,其對(duì)中性粒細(xì)胞有強(qiáng)大的趨化作用,促進(jìn)多種前炎癥因子(IL-6、IL-8、MCP-1等)釋放,在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用[13]。研究表明,各種肝臟疾病患者血清IL-17水平較正常組顯著升高,說明IL-17在多種肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但I(xiàn)L-17是否能通過促進(jìn)HSCs活化、增殖及MMP-9和TIMP-1的表達(dá)從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展目前鮮有報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)觀察到,IL-17在一定濃度能促進(jìn)HSCs α-SMA的表達(dá),說明IL-17能促進(jìn)HSCs活化。10、100、500 ng/mL的IL-17作用HSCs 48、72 h具有明顯促進(jìn)其增殖的作用,并且呈濃度-時(shí)間依賴性。同時(shí),IL-17作用HSCs 24 h能顯著提高M(jìn)MP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá)和蛋白的分泌,IL-17濃度在10、100、500 ng/mL范圍時(shí),隨著濃度的增高M(jìn)MP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增高,各濃度組與對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外我們觀察到,在一定濃度范圍內(nèi),TIMP-1/MMP-9的比值也隨藥物濃度的增加而增加。
綜上所述,IL-17在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用可能是:①激活HSCs,使之具有成纖維細(xì)胞活性;②促進(jìn)HSCs的增殖,分泌更多的ECM;③提高HSCs MMP-9的表達(dá),促進(jìn)正常的基底膜的降解,破壞HSCs的微環(huán)境,從而促進(jìn)HSCs的激活和遷移;④促進(jìn)HSCs TIMP-1的表達(dá),抑制MMPs(主要為MMP-1/MMP-13)的活性,抑制ECM的降解;⑤提高HSCs TIMP-1/ MMP-9的比值,破壞TIMPs/MMPs的平衡,使ECM代謝紊亂。
因此,通過抑制IL-17及其受體的表達(dá)、阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或許能夠?yàn)楦卫w維的預(yù)防和治療提供新的思路。
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(本文編輯:吳健敏)
Objective:To investigate the effect of Interleukin17 (IL-17) on proliferation and expression of MMP-9, TIMP-1 in rat hepatic stellate cells in vitro.Methods:The HSCs were isolated by method of Optiprep. Immunocytochemical method was used to detect the α-SMA expression of HSCs. The HSCs was treated with different concentrations of IL-17 and the proliferation of HSCs was measured by MTT. The MMP-9 and TIMP-1 mRNA levels were detected by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). While the MMP-9 and TIMP-1 protein were measured by ELISA.Results:HSCs were isolated and cultured successfully. Stimulated with IL-17 could signifcantly increase proliferation and α-SMA expression in HSCs. IL-17 could promote the MMP-9 and TIMP-1 mRNA expression and increased protein secresion in HSCs by dose depedent manner. With increased of IL-17 concentration, the value of TIMP-1/MMP-9 was markedly upregulated. Conclusion: IL-17 can promote the proliferation of HSCs and also increases α-SMA, MMP-9 and TIMP-1 expression, then upregulate the value of TIMP-1/MMP-9 in HSCs, which may play an important role in live fbrosis.
interleukin17; hepatic stellate cells; α-SMA; MMP-9; TIMP-1; rats
R657.3
A
1000-2138(2014)12-0868-05
2014-05-15
浙江省外科學(xué)重中之重學(xué)科基金資助項(xiàng)目(2008-255)。
余盼攀(1986-),男,浙江衢州人,住院醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士。
Effect of interleukin17 on collagen metabolism in hepatic stellate cells
YU Panpan1, ZHANG Qiyu2, JIN Huicheng1. 1.Department of General Surgery, the First People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou, 310000; 2.Department of General Surgery, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015