大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定

王海峰，陳 文，劉艷艷，吳王澤

(1.菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東菏澤274000;2.武漢市中心醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430014)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定

王海峰1，陳 文1，劉艷艷1，吳王澤2

(1.菏澤醫(yī)學專科學校，山東菏澤274000;2.武漢市中心醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430014)

目的 培養(yǎng)符合實驗要求的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)并進行鑒定。方法 采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，對細胞的形態(tài)及生長特性進行觀察，并應用流式細胞術(shù)對細胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90表型進行鑒定。結(jié)果 BMSCs呈貼壁生長，細胞狀態(tài)良好，細胞形態(tài)以梭形為主，有時可見少量呈多角形，細胞平行排列生長或渦旋狀生長;BMSCs高表達干細胞表面抗原CD29、CD90，而低表達造血干細胞表面抗原CD34、CD45。結(jié)論 全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs既簡單又經(jīng)濟，通過多次傳代可以達到細胞純化的目的，對細胞的性狀影響較小。

脊髓損傷;骨髓間充質(zhì)干細胞;細胞表面抗原

脊髓損傷是一類嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致殘性疾病，由于神經(jīng)系統(tǒng)的不可再生性，迄今為止，國內(nèi)外已進行的脊髓損傷治療均未取得滿意的臨床療效。近年來，隨著干細胞工程的推進，干細胞移植成為治療脊髓損傷的研究熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)打破了神經(jīng)干細胞的局限性，成為干細胞移植治療脊髓損傷的新型“種子細胞”。本文旨在采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察細胞的貼壁情況和生長特點，并采用流式細胞術(shù)對細胞進行檢測，觀察細胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠，SPF級，鼠齡30 d左右，體質(zhì)量250～300 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，合格證號:SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)［1－3］取1月齡Wistar大鼠，斷頸處死;嚴格無菌條件下取雙側(cè)后肢股骨和脛骨，去除骨表面的肌肉組織，Hanks液沖洗，剪去骨骺端，暴露骨髓腔;用5 mL的無菌注射器吸取Hanks液沖洗骨髓腔，收集沖出的骨髓細胞，反復吹打制成單細胞懸液;然后接種在T25的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。首次換液時間第3 d，以后每3 d換1次。待細胞融合達到時70%開始傳代。

1.2.2 BMSCs表面抗原檢測 體外分離培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)0.25%Tryspin-EDTA消化，常規(guī)處理后Hanks液調(diào)整細胞濃度至1×1010·L－1;取100 μL樣本分別加入以下抗體:CD29-PE/cy5、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-PE(冰上操作)。加入抗體的細胞冰上放置15～30 min，Hanks液洗1次，500 μL Hanks液重懸細胞;流式細胞儀檢測。

1.2.3 BrdU標記細胞的免疫熒光 標記原理:5－溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)為胸腺嘧啶的衍生物，在細胞S期可替代胸腺嘧啶摻入到合成的DNA中。腹腔注射BrdU或細胞培養(yǎng)時加入BrdU，然后利用抗BrdU抗體，細胞免疫熒光染色顯示BrdU可以作為一種細胞標記物［4］。BrdU作為一種嘧啶類似物，其標志方法簡單，不存在放射性污染，而且BrdU標志的細胞只要不受到紫外線的照射，對細胞就沒有功能損害［4－7］。當細胞處于DNA合成期而同時又有BrdU存在時，就會有BrdU摻入到新合成的DNA中，只要細胞不凋亡，這種BrdU就在細胞核的DNA中長期存留。細胞準備:將培養(yǎng)的細胞按適當?shù)拿芏冉臃N于6孔板內(nèi)，6孔板的每個孔都有預先放入的無菌蓋玻片。細胞貼壁生長4 d后分別在細胞移植前24、8 h加入BrdU，BrdU的終濃度為10 μmol·L－1。免疫熒光:將6孔板從培養(yǎng)箱拿出來棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，每次5 min;加入固定液(乙酸∶甲醇為1∶3)，立即吸干凈倒掉，再加入適量的固定液，－20℃放置20～30 min;PBS洗3次，每次5 min。12 mol·L－1HCl溶液37℃變性1 h，吸掉HCl溶液，PBS洗3次，每次5 min。免疫反應:用自配的抗體封閉液封閉30～60 min，棄去封閉液，將一抗Antibody-BrdU(mouse fraction，1∶1 000稀釋)加入6孔板內(nèi)，37℃40～60 min或4℃過夜;PBS洗3次，每次5 min;二抗Anti-mouse IgG-FITC(1∶800稀釋)加入，室溫避光1～2 h;PBS洗3次，每次5 min;抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

圖1 BMSCs培養(yǎng)的形態(tài)學觀察(×100)

2.1 BMSCs的細胞形態(tài)觀察 細胞接種24 h后，呈現(xiàn)貼壁性生長。72 h后更換新鮮培養(yǎng)基，細胞貼壁生長，大部分呈梭形，但有時可見呈三角形。培養(yǎng)2周左右貼壁細胞迅速增殖成簇生長或漩渦狀生長，隨著傳代和細胞優(yōu)勢的自然選擇可以得到純化。見圖1。

2.2 BMSCs的表面抗原鑒定 流式細胞儀檢測顯示:通過對不同代數(shù)的BMSCs的檢測可以看出BMSCs高表達CD90、CD29，而低表達CD34、CD45。

BMSCs第1代的鑒定結(jié)果如下，流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原的表達率分別是:CD90 95.4%、CD29 97.2%、CD34 27.7%、CD45 27.7%。

BMSCs第2代的鑒定結(jié)果如下，流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原的表達率分別是:CD90 92.6%、CD29 98.5%、CD34 9.0%、CD45 9.0%。

BMSCs第4代的鑒定結(jié)果如下，流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原的表達率分別是:CD90 93.1%、CD29 96.3%、CD34 4.5%、CD45 4.5%。

BMSCs第9代的鑒定結(jié)果如下，流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原的表達率分別是:CD90 99.5%、CD29 100.0%、CD34 1.8%、CD45 4.6%。

2.3 細胞免疫熒光檢測BrdU標記的BMSCs 移植前24 h在培養(yǎng)的BMSCs中加入BrdU，細胞免疫熒光檢測目的細胞。熒光顯微鏡下觀察:細胞核呈圓形或橢圓形，DAPI標志的細胞核呈藍色;BrdU標志的細胞核呈綠色。DAPI標志的藍色細胞核與BrdU標志的綠色細胞核的大部分融合在一起，證明BrdU可以作為BMSCs的標志物。見圖2。

DAPI能快速進入細胞并能融入細胞DNA，因此DAPI可以用于標志活體細胞。在細胞增殖期，BrdU可以替代脫氧核苷酸而且可以隨著DNA的傳代而繼續(xù)存在。因此，DAPI染色和BrdU染色可以顯示細胞的位置。DAPI標志的細胞核顯示藍色，BrdU標志的細胞核顯示綠色。

3 討論

BMSCs具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，是細胞治療和基因治療的理想靶細胞。骨髓中BMSCs的含量非常少，每10萬個單核細胞中大約只有1個BMSC［8－9］，且隨著年齡的增長細胞數(shù)量逐漸減少，如此微量的BMSCs難以滿足治療的需要。因此，尋找適宜的BMSCs體外分離、擴增、純化的方法，對于進一步研究BMSCs的生物學特性尤為重要。目前常用的方法主要有4種:全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細胞表面抗原標志分選法、細胞篩選法，其中以全骨髓貼壁法和密度梯度離心法最為常用。全骨髓貼壁法即根據(jù)干細胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化BMSCs的目的。隨著對BMSCs表面抗原認識的深入，利用免疫方法如流式細胞術(shù)、免疫磁珠等方法對其進行分離純化，但經(jīng)過上述方法分選后的細胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問題，加之耗費較大和技術(shù)難度高，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。而全骨髓貼壁法和密度梯度離心法雖然不如后2種方法獲取的細胞純度高，可是經(jīng)過傳代培養(yǎng)細胞仍然可以得到純化，而且方法簡單，細胞活性較高，成本低，步驟簡單，細胞被污染的機會小，因此不管是從技術(shù)上還是經(jīng)濟上都是分離BMSCs的理想方法。

圖2 BrdU標志BMSCs情況(×400)

BMSCs與造血干細胞、其他來源的間充質(zhì)干細胞以及神經(jīng)干細胞等一樣，是干細胞中的多能干細胞，其不僅能自身復制，而且可以“橫向分化”為各種組織細胞，F(xiàn)riedenstein等［10］首先發(fā)現(xiàn)了BMSCs的貼壁生長特性。本實驗就是利用其貼壁生長特性來分離培養(yǎng)BMSCs，用培養(yǎng)基沖出大鼠骨髓后直接置于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，骨髓中的BMSCs會貼附于培養(yǎng)瓶底生長，然后更換培養(yǎng)基逐步除去漂浮生長的造血系細胞，這樣BMSCs便可以逐步得到純化。此時還有部分淋巴細胞、單核細胞與BMSCs一起貼壁生長。淋巴細胞、單核細胞貼壁較牢固，由于BMSCs在胰蛋白酶作用下容易脫離培養(yǎng)瓶底部，在傳代時嚴格控制酶的量和消化時間，保證在短暫的作用時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，從而進一步純化BMSCs［11］。本實驗采取全骨髓貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進行分離、培養(yǎng)和擴增，所培養(yǎng)細胞的形態(tài)多呈梭形、呈集落生長，與文獻報道一致［12］。

大鼠骨髓取材的方法雖然很簡單，但是一定要注意無菌操作，否則容易造成污染而影響細胞的培養(yǎng)。取材中一般要準備2套無菌器械，一套是用來分離股骨與脛骨，另一套則是用來在超凈工作臺中收集細胞。為了盡量避免凝血，本實驗采用頸椎脫臼法處死大鼠，然后將大鼠在酒精中浸泡5 min。首先用一套器械去除皮膚和肌肉，再在超凈工作臺中用另一套器械打開骨髓腔沖出骨髓細胞，這樣就可大大減少污染的機會，整個取材過程所用的時間越短越好。

BMSCs的表面抗原并不是獨特的，其既有間質(zhì)細胞的表面抗原特征，又具有內(nèi)皮細胞、上皮細胞和肌肉細胞的表面抗原特征，因此到目前為止并未找到非常特異性的BMSCs標志分子。一般認為，CD29、CD44、CD166、CD105等是BMSCs的重要標志物［13］，而BMSCs不表達造血干細胞表面抗原，如造血前體細胞標志抗原CD34、成熟造血細胞標志抗原CD38、白細胞標志抗原CD45、淋巴細胞表面抗原CD11a和單核細胞/巨噬細胞表面抗原CD14。因為BMSCs目前還沒有公認的獨特抗原表型［14］，故本實驗從細胞形態(tài)特點及CD29、CD34、CD45、CD90 4種表面標志抗原來鑒定BMSCs。本實驗采用流式細胞術(shù)檢測細胞的表面標記，實驗結(jié)果證明培養(yǎng)的細胞高表達CD29、CD90而低表達CD34、CD45，說明本實驗培養(yǎng)的細胞即非造血干細胞，也非成纖維細胞，而是不同于造血干細胞的另一大類的干細胞，即BMSCs，與文獻［15］報道一致。

細胞移植首先遇到的問題是如何標志移植的細胞，進而跟蹤其存活、生長、分化的過程，移植細胞的標志及對其在活體內(nèi)的跟蹤是此類研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在用于細胞標志的方法主要有同位素標志、熒光標志、超順磁標志、BrdU標志及原位雜交檢測等［16－22］。本實驗采用BrdU標志，BrdU是一種嘧啶類似物，其尿嘧啶的堿基嘧啶環(huán)中與5位C原子連接的甲基被溴代替。當細胞處于DNA合成期而同時又有BrdU存在時，就會有BrdU摻入到新合成的DNA中，只要細胞不凋亡，這種BrdU在細胞核的DNA中會長期存留。與同位素和熒光標記技術(shù)相比較，BrdU抗體不與胸腺嘧啶發(fā)生交叉反應，沒有放射性，經(jīng)免疫組織化學染色即可觀察BrdU在細胞內(nèi)的摻入情況，避免了假陽性。適量的BrdU標記只要不受到紫外線的照射，一般不會產(chǎn)生大的毒副反應，對細胞生長、增殖、分化無明顯影響［7，23］。BrdU對細胞毒性小，檢測的特異性高、標志率高，而且實驗過程迅速簡便、安全，故其是反映細胞增殖及跟蹤監(jiān)測移植細胞動態(tài)變化的理想指標［24－26］。

4 結(jié)論

綜上所述，得出結(jié)論:1)BMSCs的分離方法包括全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細胞表面抗原標志分選法和細胞篩選法。由于后2種的方法費時費力，現(xiàn)在主要采用前兩者;2)細胞表面標志CD29和CD90，表達率高達90%，而低表達造血干細胞的表面標志CD34和CD45，經(jīng)過多次傳代后BMSCs得以純化;3) BrdU摻入到細胞DNA中作為細胞標記，對細胞損害作用較小，而且可以長期留在細胞內(nèi)，有利于細胞移植以后檢測移植細胞在脊髓內(nèi)的情況。

［1］ Cízková D，Rosocha J，Vanicky I，et al.Transplants of human mesenchymal stem cells improve functional recovery after spinal cord injury in the rat［J］.Cell Mol Neurobiol，2006，26(7/8):1167－1180.

［2］ Ohta M，Suzuki Y，Noda T，et al.Bone marrow stromal cells infused into the cerebrospinal fluid promote functional recovery of the injured rat spinal cord with reduced cavity formation［J］.Exp Neurol，2004，187(2):266－278.

［3］ Neuhuber B，Swanger SA，Howard L，et al.Effects of plating density and culture time on bone marrow stromal cell characteristics［J］.Exp Hematol，2008，36(9):1176－1185.

［4］ Taupin P.BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis:paradigms，pitfalls，limitations，and validation［J］.Brain Res Rev，2007，53(1):198－214.

［5］ Gratzner HG.Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine:A new reagent for detection of DNA replication［J］.Science，1982，218(4571):474－475.

［6］ King A，Burrows TD，Hiby SE，et al.Surface expression of HLA-C antigen by human extravillous trophoblast［J］.Placenta，2000，21 (4):376－387.

［7］ Meyer JS，Koehm SL，Hughes JM，et al.romodeoxyuridine labeling for S-phase measurement in breast carcinoma［J］.Cancer，1993，71 (11):3531－3540.

［8］ Lin P，Allison DC.Measurement of DNA content and of tritiated thymidine and bromodeoxyuridine incorporation by the same cells［J］.J Histochem Cytochem，1993，41(9):1435－1439.

［9］ Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284 (5411):143－147.

［10］Friedenstein AJ，Chailakhyan RK，Gerasimov UV.Bone marrow osteogenic stem cells:in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers［J］.Cell Tissue Kinet，1987，20(3):263－272.

［11］Lisignoli G，Remiddi G，Cattini L，et al.An elevated number of differentiated osteoblast colonies can be obtained from rat bone marrow stromal cells using a gradient isolation procedure［J］.Connect Tissue Res，2001，42(1):49－58.

［12］Quirici N，Soligo D，Bossolasco P，et al.Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies［J］.Exp Hematol，2002，30(7):783－791.

［13］Mangi AA，Noiseux N，Kong D，et al.Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts［J］.Nat Med，2003，9(9):1195－1201.

［14］De Ugarte DA，Alfonso Z，Zuk PA，et al.Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow［J］.Immunol Lett，2003，89 (2/3):267－270.

［15］Peister A，Mellad JA，Larson BL，et al.Adult stem cells from bone marrow(MSCs)isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes，rates of proliferation，and differentiation potential［J］.Blood，2004，103(5):1662－1668.

［16］Wulf GG，Jackson KA，Goodell MA.Somatic stem cell plasticity: current evidence and emerging concepts［J］.Exp Hematol，2001， 29(12):1361－1370.

［17］Menon LG，Picinich S，Koneru R，et al.Differential gene expression associated with migration of mesenchymal stem cells to conditioned medium from tumor cells or bone marrow cells［J］.Stem Cells，2007，25(2):520－528.

［18］Urbán VS，Kiss J，Kovács J，et al.Mesenchymal stem cells cooperate with bone marrow cells in therapy of diabetes［J］.Stem Cells，2008，26(1):244－253.

［19］Klopp AH，Spaeth EL，Dembinski JL，et al.Tumor irradiation increases the recruitment of circulating mesenchymal stem cells into the tumor microenvironment［J］.Cancer Res，2007，67(24): 11687－11695.

［20］Gao J，Dennis JE，Muzic RF，et al.The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion［J］.Cells Tissues Organs，2001，169(1):12－20.

［21］Segers VF，Van Riet I，Andries LJ，et al.Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium:activators and mechanisms［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(4):H1370－H1377.

［22］Sasaki M，Abe R，F(xiàn)ujita Y，et al.Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type［J］.J Immunol，2008，180(4):2581－2587.

［23］Kunter U，Rong S，Boor P，et al.Mesenchymal stem cells prevent progressive experimental renal failure but maldifferentiate into glomerular adipocytes［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(6):1754－1764.

［24］Lin P，Allison DC.Measurement of DNA content and of tritiated thymidine and bromodeoxyuridine incorporation by the same cells［J］.J Histochem Cytochem，1993，41(9):1435－1439.

［25］Munoz-Elías G，Woodbury D，Black IB.Marrow stromal cells，mitosis，and neuronal differentiation:stem cell and precursor functions［J］.Stem Cells，2003，21(4):437－448.

［26］Nakamura S，Takeda Y，Kanno M，et al.Application of bromodeoxyuridine(BrdU)and anti-BrdU monoclonal antibody for the in vivo analysis of proliferative characteristics of human leukemia cells in bone marrows［J］.Oncology，1991，48(4):285－289.

Isolation，Cultivation and Identification of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Rats

Wang Haifeng1，Chen Wen1，Liu Yanyan1，Wu Wangze2
(1.Heze Medical College，Heze 274000，China; 2.Department of Medical Laboratory，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430014，China)

ObjectiveTo culture and identify the rat marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)fitting the requirement of experimentation.MethodsWhole bone marrow adherent culture method in vitro was used to culture the BMSCs of rats in vitro，the morphology and characteristics of the cells was observed，the phenotypes of CD29，CD34，CD45 and CD90 were identified by flow cytometry.ResultsBMSCs stuck wall growth in good condition，cells in a spindle primarily forms into fiber cell sample growth，sometimes visible small amounts of a polygonal cells，parallel arrangement growth or vortex shape growth.High expression of stem cell surface molecular(CD29 and CD90)and low expression of hematopoietic stem cell surface molecular(CD34 and CD45)were observed in the BMSCs.ConclusionWhole bone marrow adherent culture method is simple and economical BMSCs culture method，the purified cells can be achieved through the passage，and the method has the little effect on cell trait.

spinal cord injury;bone marrow mesenchymal stem cells;cell surface antigen

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.002

R329

A

1673－5412(2014)02－0097－05

王海峰(1987－)，女，碩士，主要從事腫瘤病因?qū)W的研究。E-mail:luckydogwang@163.com

2013－02－06)