金線蓮叢生芽的增殖和壯苗生根

□王小敏，黃肇宇，莫昭展*，黃超群，黃夢(mèng)姿

（1.玉林師范學(xué)院 ，廣西 玉林 537000；2.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530005）

金線蓮叢生芽的增殖和壯苗生根

□王小敏1，黃肇宇1，莫昭展1*，黃超群2，黃夢(mèng)姿1

（1.玉林師范學(xué)院 ，廣西 玉林 537000；2.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530005）

通過對(duì)不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果進(jìn)行對(duì)比分析后篩選出適宜金線蓮的生長(zhǎng)的培養(yǎng)基分別是：叢生芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA3mg/L+NAA0.8mg/L，兩個(gè)月的增殖系數(shù)達(dá)到4.5；壯苗最佳培養(yǎng)基為MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L+香蕉汁20%；生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+IBA1mg/L+NAA1mg/L+香蕉汁20%+Ac0.8g/L,生根率達(dá)100%.

金線蓮；叢生芽；增殖；壯苗生根

金線蓮是蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoec-tochilus)的多年生草本植物，別名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金錢仔草、金線虎頭蕉、金線入骨消等[1]，是民間使用較廣的一種傳統(tǒng)珍貴藥材，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、滋陰潤(rùn)肺、降血壓、平肝等功效[2].其株型小巧，葉型美觀，葉脈金黃色網(wǎng)狀排列，具有極高的觀賞價(jià)值[3].但由于金線蓮對(duì)生態(tài)條件要求較嚴(yán)，而適應(yīng)性較差，其蘊(yùn)藏量甚少，山間蛇、鼠和鳥等飛禽走獸喜食，加上人為的大量掠奪性采集和生態(tài)環(huán)境的破壞，野生金線蓮資源日漸稀少，開發(fā)金線蓮產(chǎn)業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益.近年來，國(guó)內(nèi)對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)進(jìn)行一些研究，主要探討基本培養(yǎng)基、激素配比、有機(jī)添加物及培養(yǎng)條件對(duì)金線蓮組織培養(yǎng)的影響，但仍然存在污染率較高、繁殖系數(shù)較低等問題[4].本試驗(yàn)通過采集種子建立無菌體系，誘導(dǎo)出叢生芽進(jìn)行增殖和壯苗生根研究，為工廠化育苗提供科學(xué)依據(jù).

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為廣西玉林市采集的野生金線蓮成熟種子.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 種子的消毒及無菌萌發(fā)

采集七八成熟的果實(shí)，先用洗潔精清洗表面，自來水沖洗干凈，然后在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡30S，再用0.1%的升汞消毒10min，再用無菌水沖洗5～6遍.剖開果實(shí)取出果實(shí)內(nèi)的種子在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5 mel mg/L +NAA1.2mg/L上進(jìn)行種子的萌發(fā)，誘導(dǎo)出叢生芽.當(dāng)芽苗達(dá)到一定程度時(shí)，切下轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng).分化增殖到一定數(shù)量后選取正常的芽苗接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗和生根培養(yǎng).

2.2.2 培養(yǎng)基

（1）繼代增殖培養(yǎng)基：MS+ 6-BA2～4 mg/L +LNAA0.4～0.8 mg/L.

（2）壯苗培養(yǎng)基：MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L，再分別附加香蕉汁20%、馬鈴薯汁20%、磷酸二氫鉀100mg/L、水解酪蛋白500mg/L.

（3）生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MS+6-BA 0.5～2 mg/L + NAA0.5～1 mg/L，每個(gè)處理中均添加香蕉汁20%，碳粉0.8g/L；

上述培養(yǎng)基分別附加30g/L蔗糖，4g/L瓊脂，pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)基分別裝在1.1Kg/cm2高壓、121℃高溫下滅菌20min.培養(yǎng)溫度為23～27℃，光照強(qiáng)度1500-3000Lx，光照培養(yǎng)12h/d.

3 結(jié)果與分析

3.1 不同激素對(duì)金線蓮不定芽增殖的影響

叢生芽接種在培養(yǎng)基上經(jīng)過60天生長(zhǎng)后，不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的效果如表1.

表1 不同濃度的6-BA和NAA對(duì)金線蓮叢生芽增殖的影響Table1 Effect of different concentrations of 6-BA and NAA forAnoectochilus roxburghiimultiple shoot clumps regeneration

叢生芽增殖系數(shù)＝繼代后新萌發(fā)的芽苗總數(shù)/繼代芽苗總數(shù)

6-BA屬于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中的細(xì)胞分裂素類，是一類能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂或分化的植物激素[5]，同時(shí)，6-BA還可以延緩組織衰老，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，抑制頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)側(cè)芽的生長(zhǎng).NAA屬于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中的生長(zhǎng)素類，一般與一種細(xì)胞分裂素配合使用[6].在植物組織培養(yǎng)中常用6-BA進(jìn)行試管苗的增殖，效果較好.在本次試驗(yàn)中，兩者的配合使用，達(dá)到了較好的效果，金線蓮的增殖系數(shù)較高.

通過對(duì)金線蓮的不定芽增殖實(shí)驗(yàn)分析顯示(表1)，在本次實(shí)驗(yàn)因素中6-BA的最適濃度為3mg/L，其次是4mg/L，最差的是2mg/L.NAA的最適濃度為0.8mg/L，其次是0.4mg/L.在這兩種因素中，6-BA對(duì)金線蓮增殖率的影響最大，其次是NAA.

經(jīng)LSR差異顯著性測(cè)定，添加6-BA濃度為3mg/L時(shí)與添加量4mg/L的增殖差異性達(dá)到顯著水平但沒達(dá)到極顯著水平，而添加量為2mg/L時(shí)與添加量為3mg/L增殖差異性都達(dá)到極顯著水平，說明較高濃度的6-BA對(duì)苗的不定芽的增殖有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度為3mg/L時(shí)增殖效果最好，高于或低于這個(gè)濃度增殖率就會(huì)下降.在高濃度的6-BA的條件下NAA對(duì)金線蓮增殖并沒有明顯的促進(jìn)作用，但在低濃度的6-BA時(shí)編號(hào)A1、A2增殖差異性達(dá)到極顯著水平，NAA為0.8mg/L時(shí)增殖效果較好.在6-BA濃度為3mg/L時(shí)，添加NAA0.8mg/L和0.4mg/L并沒有表現(xiàn)出差異顯著性，但添加NAA0.8mg/L的培養(yǎng)基中，金線蓮的增殖系數(shù)達(dá)到4.5，苗也是最健壯，長(zhǎng)勢(shì)最旺的，故此本實(shí)驗(yàn)中6-BA3mg/L+NAA0.8mg/L兩種激素相結(jié)合使用時(shí)，最適金線蓮不定芽的增殖.

3.2 不同附加物對(duì)金線蓮壯苗的影響

在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，添加附加物香蕉汁20%對(duì)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的影響更為明顯，結(jié)果見表2.從表中可看出添加20%香蕉汁時(shí)苗的平均株高、平均葉片數(shù)及莖的平均徑粗都達(dá)到了最大值，且苗的生長(zhǎng)力旺盛.經(jīng)LSR差異顯著性測(cè)定，添加20%的香蕉汁和添加20%馬鈴薯汁相比在平均株高、平均葉片數(shù)上都達(dá)到了顯著水平而未達(dá)到極顯著水平，但在平均徑粗上未達(dá)到顯著水平，說明20%馬鈴薯汁對(duì)金線蓮壯苗也有一定的促進(jìn)作用.20%香蕉汁與水解酪蛋白、磷酸二氫鉀在所測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)上都達(dá)到了極顯著水平，20%馬鈴薯與水解酪蛋白和磷酸二氫鉀相比，除了在平均徑粗上達(dá)到了顯著水平，在平均株高和平均葉片數(shù)上都未到達(dá)顯著水平，水解酪蛋白和磷酸二氫鉀相比，除了在平均直徑上達(dá)到了顯著水平，在平均株高和平均葉片數(shù)上都未到達(dá)顯著水平，說明水解酪蛋白、磷酸二氫鉀對(duì)金線蓮壯苗作用不大.

表2 不同附加物對(duì)金線蓮壯苗的影響Table2 Effect of different additives onAnoectochilus roxburghiistrong seedling

3.3 不同激素配比對(duì)金線蓮生根的影響

組織培養(yǎng)快速繁殖過程最后一關(guān)是試管苗的移栽，移栽是否成活與根息息相關(guān)，因此，生根及根的質(zhì)量是組培快繁的一個(gè)重要的環(huán)節(jié).為此，在本次實(shí)驗(yàn)中，主要研究不同激素對(duì)金線蓮生根率和平均生根數(shù)的影響，以便誘導(dǎo)出根粗壯的試管苗，提高移栽的成活率.表3顯示，IBA 1mg/L和NAA 1mg/L配合使用對(duì)苗的生根最好，生根率達(dá)到100%而且苗株高較高，根多且粗壯.編號(hào)C1和C3之間差異達(dá)到極顯著水平，C3的苗比C1的苗生根率高出將近2倍，且根鍵壯長(zhǎng)勢(shì)好，說明IBA對(duì)金線蓮生根有明顯的促進(jìn)作用.編號(hào)C1與C5、C6相比差異達(dá)到極顯著水平，而C1的生根率和苗的長(zhǎng)勢(shì)在下降，說明金線蓮的生根率與長(zhǎng)勢(shì)隨著IBA濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)到1mg/L生根率及長(zhǎng)勢(shì)達(dá)到最佳，超過這個(gè)濃度將抑制苗生根，生根率下降，但在2mg/L以處于較高濃度的激素水平的生根率仍明顯高低濃度.C1與C2之間也達(dá)到了極顯著水平，說明1mg/L的NAA對(duì)金線蓮的生根作用大于0.5mg/L.但C6與C5相比，雖未達(dá)到顯著水平，但從苗生長(zhǎng)情況來及生根率來說，1mg/L的NAA對(duì)苗的生根及苗生長(zhǎng)發(fā)揮一定作用，有利于提高后期的移栽的成活率.本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論1mg/L的IBA與1mg/L的NAA配合時(shí)最適金線蓮的生根.

表3 不同激素對(duì)金線蓮生根的影響Table3 Effects of different phytohormones combination onAnoectochilus roxburghiirooting

4 結(jié)論與討論

金線蓮為典型的蔭性藥用植物, 常生長(zhǎng)在蔭蔽的闊葉林下的肥沃腐葉土中，對(duì)林中空氣、溫度、光照、積溫等生態(tài)條件要求嚴(yán)格，近年來金線蓮主產(chǎn)地的森林植被，水土遭受不同程度破壞，再由于人工的過度采挖，野生資源銳減.利用野生資源進(jìn)行組培快繁是解決資源匱乏的有效途徑之一.

本研究基于野生金線蓮種子為外植體進(jìn)行組培快繁研究，在培養(yǎng)各環(huán)節(jié)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，摸索出一種增殖系數(shù)及移栽成活率高的培養(yǎng)體系.在金線蓮叢生芽增殖階段采用不同激素配比，尤其是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素進(jìn)行配合使用，能有效的促進(jìn)叢生芽的增殖.在使用6-BA時(shí)，不定芽的增殖系數(shù)隨著激素濃度的增加，芽的增殖系數(shù)大，當(dāng)6-BA的濃度達(dá)到3.0mg/L時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最高，當(dāng)濃度超過3mg/L時(shí)增殖系數(shù)下降，與江建銘[7]及陳兆貴[4]得出的結(jié)果一致，而羅慶國(guó)[8]及宋麗莎[9]則認(rèn)為最適金線蓮叢生芽增殖的6-BA濃度均為1mg/L，可能與激素的質(zhì)量或不同的金線蓮品系有關(guān).在含適宜濃度的6-BA培養(yǎng)基中，添加NAA可以進(jìn)一步提高增殖系數(shù)，其中以NAA2.0mg/L的濃度為佳.可見不同激素共同使用時(shí)，起到協(xié)同作用，促進(jìn)芽的生長(zhǎng).

在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當(dāng)?shù)奶烊挥袡C(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育.植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[10].本實(shí)驗(yàn)的研究表明香蕉汁對(duì)金線蓮壯苗效果突出，與對(duì)照組比較，在株高、葉片數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)上都達(dá)到極顯著差異.馬鈴薯的提取物對(duì)金線蓮壯苗作用不及香蕉提取物，但在平均莖粗上也與對(duì)照差異顯著，長(zhǎng)勢(shì)良好.

在實(shí)驗(yàn)中用IBA和NAA對(duì)金線蓮進(jìn)行生根的誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在這兩種激素中IBA起到主導(dǎo)作用.金線蓮的生根率隨著IBA的濃度增高而增高，濃度達(dá)到1mg/L時(shí)生根率達(dá)到100%，再添加1mg/L NAA時(shí)根壯，苗高，有利于試管苗的移栽成活. ■

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【責(zé)任編輯 謝文?！?/p>

The multiplication and Rooting ofAnoectochilus RoxburghiiMultiple Shoot

WANG Xiao-min1, HUANG Zhao-yu1, MO Zhao-zhan1*, HUANG Zhao-yu1, HUANG Chao-qun2, HUANG Meng-zhi1
(1. Yulin Normal University,Yulin, Guangxi , 537000；2. Guangxi University, Nanning, Guangxi , 537005)

After the comparative analysis on the culture effect of different media ofAnoectochilus Roxburghii, the optimum media were as follows: MS + 6-BA3mg/L +NAA0.8mg/L gave the best result for multiple shoot clumps regeneration and multiplication coefficient was more than 4.5 within 2 months. The optimum media for strong seedling was MS +NAA2mg/L +6-BA1mg/L +banana juice20%. The 1/2MS+IBA1mg/L+NAA1mg/L+ banana juice 20%+Ac0.8g/L was the best media for rooting and the rooting rate was 100%.

Anoectochilus Roxburghii; multiple shoot clumps; regeneration; strong seedling and rooting

S682.31

A

1004-4671（2014）05-0054-05

2014-06-24

廣西科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目 (桂科重1355001-5-3)，玉林市科技攻關(guān)項(xiàng)目(玉市科攻12102018)。廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（2013LX119）。

王小敏(1979～), 男，漢族，廣西全州人，玉林師范學(xué)院講師，博士，主要研究方向：植物細(xì)胞工程與基因工程。*

莫昭展（1974～），男，壯族，廣西博白人，教授，博士，主要研究方向：植物資源開發(fā)利用的教學(xué)與研究。