原生質(zhì)體激光誘變選育假白布勒彈孢酵母輔酶Q10高產(chǎn)菌株

趙有璽，龔 平，羅忠智，冀頤之（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

原生質(zhì)體激光誘變選育假白布勒彈孢酵母輔酶Q10高產(chǎn)菌株

趙有璽，龔 平，羅忠智，冀頤之*
（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

對一株產(chǎn)輔酶Q10的菌株假白布勒彈孢酵母BUQ-3進行了原生質(zhì)體制備、再生及激光誘變育種的研究。結(jié)果顯示假白布勒彈孢酵母BUQ-3原生質(zhì)體形成及再生的最佳條件為：菌齡26h，蝸牛酶濃度2g/L，酶溶液pH7.5，酶解溫度25℃，酶解時間1.5h。He-Ne激光誘變的最佳誘變時間為4.5min。以色素突變型為篩選模型，經(jīng)激光誘變，獲得具有遺傳穩(wěn)定特性的高產(chǎn)突變株BUQJ-012，其輔酶Q10產(chǎn)量比親本株提高了87%，達到1.53mg/L。

假白布勒彈孢酵母，輔酶Q10，原生質(zhì)體，激光，誘變選育

輔酶Q10（CoQ10）是一種存在于動、植物及微生物中的脂溶性醌類化合物，具有細胞抗氧化[1]、阻止細胞凋亡[2]、輔助線粒體膜質(zhì)子梯度解偶聯(lián)[3]、增強免疫系統(tǒng)的消炎功能[4]等重要的生理作用，廣泛的應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[5-7]。

輔酶Q10可由動植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法三種生產(chǎn)方法獲得[8]，其中利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10具有原料成本低、無光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性高，臨床應(yīng)用效果好，可實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)勢，目前已成為最具發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產(chǎn)方法[9]。然而，微生物發(fā)酵法中存在的最大問題是：發(fā)酵菌株普遍不能積累高水平輔酶Q10、發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高[10]。通過從自然界中篩選高產(chǎn)輔酶Q10菌株，并對其代謝途徑進行研究，通過誘變育種和基因工程手段提高菌株的產(chǎn)量成為目前研究的熱點[11-12]。由于輔酶Q10合成途徑復(fù)雜，基因工程高產(chǎn)菌株的構(gòu)建至今尚未取得突破性進展[13]。因此，采用傳統(tǒng)的物理或化學(xué)方法進行誘變育種，仍是提高輔酶Q10產(chǎn)量較為有效的途徑[14]。

原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)是一種重要的工業(yè)微生物育種技術(shù)。原生質(zhì)體因失去了細胞壁的保護而對外界刺激更為敏感，從而更易顯現(xiàn)誘變的生物學(xué)效應(yīng)，有利于高產(chǎn)菌株篩選。激光誘變技術(shù)是一種新型的誘變技術(shù)，在微生物誘變研究上取得了較好的結(jié)果[15]。目前，利用原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)選育高產(chǎn)輔酶Q10菌株的研究還未見報道。本文探討了假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生條件，并對原生質(zhì)體激光誘變條件進行了研究，以表型效應(yīng)-色素突變株作為輔酶Q10高產(chǎn)菌的篩選模型進行篩選，以期為輔酶Q10的原生質(zhì)體激光育種工作提供一定的理論依據(jù)及實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假白布勒彈孢酵母（Bullera pseudoalba）BUQ-3本實驗室保藏；CoQ10標(biāo)準(zhǔn)樣品 Sigma公司；蝸牛酶、β-巰基乙醇 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；EDTA·Na2北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司；蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tris 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；焦性沒食子酸 廣西汕頭市西隴化工廠。

SJ-8型He-Ne激光器 河北迪生醫(yī)療器械有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；5810R型高速離心機 eppendorf；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨10，pH6.0。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨5，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.3，pH自然。

1.2.3 再生培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母浸粉5，蛋白胨10，蔗糖100，瓊脂粉20，pH6.0。

1.3 試劑制備

1.3.1 0.5mol/L EDTA溶液 在800mL水中加入186.1g EDTA-Na2·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至1L。

1.3.2 ST溶液 蔗糖171.15g/L，MgCl2·6H2O 2.03g/L，Tris 1.21g/L，用0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH，滅菌后備用。1.3.3 STC溶液 ST溶液中加入CaCl21.11g/L，滅菌后備用。

1.3.4 蝸牛酶液 按一定比例將蝸牛酶溶于10mL ST溶液中，并用微孔濾膜過濾除菌。

1.3.5 前處理液 10mL 0.05mol/L EDTA溶液中加入14滋L β-巰基乙醇。

1.4 實驗方法

1.4.1 搖瓶培養(yǎng) 將假白布勒彈孢酵母斜面菌種取一環(huán)接種至種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶裝50mL，27℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)1d。然后再將其轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶裝50mL，接種量5%，27℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)2d。

1.4.2 輔酶Q10的提取 10000r/min，10min離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，采用皂化法[16]進行輔酶Q10提取。

1.4.3 紫外分光光度法測定輔酶Q10含量

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取1mg輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容至100mL，配成質(zhì)量濃度為10滋g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10mL，在輔酶Q10最大吸收波長275nm處測定其吸光度值。

1.4.3.2 輔酶Q10質(zhì)量濃度的測定 在275nm處測定輔酶Q10提取液的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)的輔酶Q10含量。

1.4.4 生長曲線的測定 按方法1.4.1進行搖瓶培養(yǎng)，每隔一段時間取樣，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以空白培養(yǎng)基為對照，在560nm下測定其吸光度，并根據(jù)吸光度繪制假白布勒彈孢酵母生長曲線。

1.4.5 原生質(zhì)體的制備與再生 3500r/min離心10min收集培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體，生理鹽水離心洗滌2次，將細胞懸浮于10mL前處理溶液中，恒溫水浴30℃振蕩處理10min。前處理后菌液適當(dāng)稀釋，涂布平板，記錄細胞菌落數(shù)A。將前處理后的菌液3500r/min離心10min收集菌體。方法同前面描述，將菌體懸浮于一定濃度和pH的蝸牛酶溶液中，水浴振蕩進行酶解。酶解后3000r/min離心10min收集細胞備用。一組酶解細胞，用ST溶液離心洗滌后重懸于ST溶液中，經(jīng)無菌水適當(dāng)稀釋后，涂布于固體培養(yǎng)基平板上，27℃培養(yǎng)2～3d，待菌落形成后，記錄未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)B，計算原生質(zhì)體形成率，見式（1）。另一組酶解細胞，用STC溶液離心洗滌后重懸于STC溶液中，STC溶液適當(dāng)稀釋后，取0.1mL稀釋液加入45～50℃再生培養(yǎng)基軟瓊脂中，搖勻后迅速倒入再生固體培養(yǎng)基平板上，27℃倒置培養(yǎng)2～3d，形成菌落即為原生質(zhì)體再生菌落及未形成原生質(zhì)體的菌落之和C。計算原生質(zhì)體的再生率，見式（2）。

1.4.6 原生質(zhì)體的制備與再生條件優(yōu)化實驗

1.4.6.1 不同酶濃度實驗 將前處理后的菌體分別懸浮于濃度為0.5、1、1.5、2、2.5g/L的蝸牛酶溶液中，pH7，30℃水浴振蕩，酶解1h。酶解后，進行原生質(zhì)體的再生，并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.2 不同酶溶液pH實驗 將前處理后的菌體分別懸浮于酶溶液pH為6.0、6.5、7.0、7.5的2g/L的蝸牛酶溶液中，30℃水浴振蕩，酶解1h。酶解后，進行原生質(zhì)體的再生，并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.3 不同酶解溫度實驗 將前處理后的菌體懸浮于2g/L的蝸牛酶溶液中，pH7.5，水浴溫度20、25、30、35℃，振蕩酶解1h。酶解后，進行原生質(zhì)體的再生，并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.6.4 不同酶解時間實驗 將前處理后的菌體懸浮于2g/L的蝸牛酶溶液中，pH7.5，25℃水浴振蕩，酶解時間分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h。酶解后，進行原生質(zhì)體的再生，并計算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

1.4.7 He-Ne激光誘變時間的確定 開啟He-Ne激光，將功率調(diào)節(jié)至12W，預(yù)熱30min后，將裝有200滋L假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體懸液的試管垂直置于激光照射鏡頭上，進行激光誘變，誘變時間分別為：1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0min。誘變后，進行原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)，計算致死率，見式（3）。

其中，D為未誘變對照組在再生平板上的菌落，E為激光誘變組在再生平板上的菌落數(shù)。

1.4.8 激光誘變及突變株的篩選 在最佳誘變時間下對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體進行He-Ne激光誘變。誘變后進行原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)，觀察再生菌落的顏色變化，選擇顏色發(fā)生變化的菌落，即色素突變型作為初篩對象，分別進行搖瓶發(fā)酵實驗，提取胞內(nèi)輔酶Q10并進行含量的檢測。

1.4.9 遺傳穩(wěn)定性實驗 將復(fù)篩獲得的高產(chǎn)菌株斜面?zhèn)?0代，考察其菌落顏色變化情況，同時進行搖瓶發(fā)酵，檢測胞內(nèi)輔酶Q10含量，以確定其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照方法1.4.3，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液在275nm處的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。其線性回歸方程為y=0.47958x+0.01602，相關(guān)系數(shù)為R2=0.99919。

圖1 輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of coenzyme Q10

2.2 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的制備

2.2.1 制備原生質(zhì)體最佳菌齡的確定 由圖2可知，假白布勒彈孢酵母0～4h為其延滯期，菌體生長處于靜止?fàn)顟B(tài)，菌數(shù)增幅較小，此期菌體正在合成生長所需酶類；4～26h菌體生長旺盛，OD值呈指數(shù)增加，此期為菌體對數(shù)生長期；26～50h OD值在一定范圍趨于平穩(wěn)，菌體達到穩(wěn)定期；50h后生長曲線呈迅速下降趨勢，菌體進入衰亡期。

制備原生質(zhì)體時，處于不同生長時期的菌體，對各種溶壁酶的敏感性不同，菌齡過短，可制備原生質(zhì)體菌量過少，原生質(zhì)體形成率較低；菌齡過大，酶解效果較差，不宜形成原生質(zhì)體。本實驗選擇假白布勒彈孢酵母菌體對數(shù)期中后期，菌齡為26h的菌體進行原生質(zhì)體制備，此時菌體生長旺盛，菌量多，對溶壁酶較敏感，易形成原生質(zhì)體。

圖2 假白布勒彈孢酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of Bullera pseudoalba

2.2.2 酶濃度對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察不同濃度蝸牛酶對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體形成及再生的影響，結(jié)果如圖3所示。假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率隨酶濃度的增大而逐漸升高，蝸牛酶酶濃度為2g/L時，其原生質(zhì)體的形成率最高，可達到25.53%。而再生率卻隨著酶濃度的升高變化不大，基本處于21%～22%之間。綜合考慮原生質(zhì)體的形成率和再生率，確定2g/L蝸牛酶濃度為最佳酶解濃度。

圖3 酶濃度對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.3 Effect of snail enzyme content on protoplast preparation and regeneration

2.2.3 pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響。結(jié)果如圖4所示，假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率是隨pH變化呈拋物線狀，酶溶液pH為7.0時原生質(zhì)體的形成率最高，達到22.79%，pH為6.5和7.5時形成率相近，分別為20.69%和20.41%；pH為6.0時，形成率最低為19.72%。而假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的再生率卻在pH7.5時最高，達到23.33%。分析原因可能是pH為7時，酶解作用較強，原生質(zhì)數(shù)形成率較高。但此時細胞脫壁太徹底，失去了細胞壁再生的基礎(chǔ)，因此導(dǎo)致了較低的再生率。綜合考慮原生質(zhì)體形成率和再生率，選擇兩者乘積最大值的pH7.5為最佳酶解條件。

圖4 酶溶液pH對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.4 Effect of enzyme system pH on protoplast preparation and regeneration

2.2.4 酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響 考察了不同溫度對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生的影響。結(jié)果如圖5所示，酶解溫度為25℃和30℃時原生質(zhì)體的形成率較高，分別達到22.7%和22.97%。酶解溫度為20℃和35℃時，原生質(zhì)體的形成率卻有所下降，在20%左右。原生質(zhì)體的再生率在35℃時最高，為23.33%。分析原因可能是因為25～30℃為酶解的最適溫度，因此酶解更徹底，形成的原生質(zhì)體數(shù)較多。但同樣最適的酶解作用對原生質(zhì)體細胞壁結(jié)構(gòu)破壞較大，從而導(dǎo)致了較低的再生率。綜合考慮原生質(zhì)體形成率和再生率，選擇25℃為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on protoplast preparation and regeneration

2.2.5 酶解時間對原生質(zhì)體制備及再生的影響 酶解時間對原生質(zhì)體制備的質(zhì)量和產(chǎn)量是較為重要的因素，酶解時間過短，原生質(zhì)體形成不完全，酶解時間過長，對細胞壁結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致原生質(zhì)體的再生率下降。不同酶解時間實驗結(jié)果如圖6所示，假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的形成率是隨酶解時間的增加呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，酶解3.5h時其原生質(zhì)體形成率達到最大值26.7%。原生質(zhì)體的再生率隨著酶解時間的延長而出現(xiàn)緩慢下降的趨勢?；诩骖櫾|(zhì)體的形成率和再生率的原則，選擇1.5h為其最佳酶解時間，此條件下原生質(zhì)體的形成率為25.6%，再生率為22.8%。

圖6 酶解時間對原生質(zhì)體制備及再生的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on protoplast preparation and regeneration

2.3 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體激光誘變

2.3.1 He-Ne激光誘變時間的確定 選擇不同誘變時間對假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體進行He-Ne激光誘變，實驗結(jié)果如圖7所示。通常認(rèn)為宜選擇致死率在70%～80%的誘變劑量，在此劑量范圍內(nèi)，雖產(chǎn)量提高幅度較小，但正突變幾率較大。He-Ne激光誘變工作劑量為4.5min時假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體的致死率為77%，因此確定4.5min為He-Ne激光誘變最佳誘變時間。

圖7 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體激光誘變致死率Fig.7 The mortality rate of the protoplast of Bullera pseudoalba induced by He-Ne laser

2.3.2 He-Ne激光誘變及突變株篩選 假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體經(jīng)He-Ne激光誘變后，獲得色素突變菌株31株。搖瓶復(fù)篩測定其胞內(nèi)輔酶Q10含量，獲得4株輔酶Q10高產(chǎn)突變菌株。實驗結(jié)果如表1所示，其中突變菌株BUQJ-012胞內(nèi)輔酶Q10含量最高，達到1.53mg/L，較出發(fā)菌株BUQ-3提高了87%。分析原因可能是由于激光輻照使親本株代謝途徑發(fā)生改變[17-18]。輔酶Q10和類胡蘿卜素的微生物合成途徑中都存在一個相同的聚異戊二稀長鏈的合成途徑，因此理論上若誘變使胡蘿卜素和輔酶Q10相同合成途徑中的前體物質(zhì)增加，則可促進兩者產(chǎn)量的增加；而若能阻斷兩者相同合成途徑后的胡蘿卜素的合成途徑的物質(zhì)的生成，則也能對輔酶Q10的合成產(chǎn)生積極的影響[19]。代謝途徑的改變直接導(dǎo)致色素產(chǎn)物積累量的變化，表觀則表現(xiàn)為菌落顏色的改變。本實驗野生菌株呈深黃色，激光誘變之后可獲得紅色、粉色、橙色、白色等色素突變株，所獲得的輔酶Q10高產(chǎn)突變菌株BUQJ-012為橙色突變株。

表1 突變株輔酶Q10產(chǎn)量Table 1 The coenzyme Q10production of mutant

2.3.3 遺傳穩(wěn)定性研究 選擇突變菌株BUQJ-012進行遺傳穩(wěn)定型實驗，將BUQJ-012連續(xù)傳代10次，分別測定其胞內(nèi)輔酶Q10含量，考察突變株的穩(wěn)定性。所得結(jié)果如表2所示，突變株BUQJ-012胞內(nèi)輔酶Q10含量維持在1.53mg/L左右，菌體形態(tài)未發(fā)生變異，表明He-Ne激光誘變所獲得的高產(chǎn)突變株BUQJ-012具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究對輔酶Q10生產(chǎn)菌株假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體制備及再生條件進行了優(yōu)化。選擇26h為假白布勒彈孢酵母菌體進行原生質(zhì)體制備的最佳菌齡；蝸牛酶濃度2g/L，酶溶液pH7.5，酶解溫度25℃，酶解時間1.5h為最優(yōu)酶解條件。為制備大量的假白布勒彈孢酵母原生質(zhì)體以用于其菌種性能的改造奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

Breeding of the coenzyme Q10producing strain Bullera pseudoalba by laser induced protoplast mutagenesis

ZHAO You-xi，GONG Ping，LUO Zhong-zhi，JI Yi-zhi*
（Biochemical Engineering College，Beijing Union University，Beijing 100023，China）

The conditions of protoplast formation，regeneration and laser mutagenesis of Bullera pseudoalba BUQ-3strain were studied.As a result，the optimal conditions for protoplast preparation and regeneration of Bullera pseudoalba BUQ-3strain were showed as follows：26h of cell growth time，the content of snail enzyme was 2g/L，the pH of enzyme system was 7.5，enzymolysis temperature was 25℃，enzymolysis time was 1.5h. The optimal time of Laser induced was 4.5min.The coenzyme Q10high yield mutant strain with good genetic stability，numbered BUQJ-012，was obtained based on pigment mutants.Its coenzyme Q10yield was up to 1.53mg/L，which was 87%higher than that of the parent strain.

Bullera pseudoalba；coenzyme Q10；protoplast；laser；mutation breeding

TS201.2

A

1002-0306（2014）14-0230-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.042

2014－04－18 *通訊聯(lián)系人

趙有璽（1979-），男，碩士研究生，講師，主要從事工業(yè)微生物方面的研究。

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目（2012D005022000007）；啟明星大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（201411417SJ085）。