能抑制引起泡菜“生花”腐敗菌的乳酸菌的篩選

敖曉琳，蒲 彪，蔡義民，陳 岑，胡愛(ài)華，陳安均（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品學(xué)院，四川雅安6504；.日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心，日本茨城305-8686）

能抑制引起泡菜“生花”腐敗菌的乳酸菌的篩選

敖曉琳1，蒲 彪1，蔡義民2，陳 岑1，胡愛(ài)華1，陳安均1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品學(xué)院，四川雅安625014；2.日本國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心，日本茨城305-8686）

從優(yōu)質(zhì)泡菜水中分離出的7株乳酸菌用于對(duì)引起泡菜生花的4種腐敗菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，通過(guò)牛津杯法、液體培養(yǎng)（產(chǎn)膜、沉淀、液體混濁度），以及乳酸菌的發(fā)酵上清液對(duì)腐敗菌抑菌率的測(cè)定，篩選出具有較強(qiáng)抑制4種腐敗微生物生長(zhǎng)和代謝的菌株SCP53（Lactobacillus plantarum）。將乳酸菌SCP53與腐敗菌共同接種發(fā)酵蘿卜，結(jié)果證實(shí)該菌株確實(shí)能起到抑制泡菜生花，改善泡菜品質(zhì)的作用。

泡菜，乳酸菌，腐敗菌，抑菌能力，篩選

泡菜以酸、香、脆、嫩的特點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。在泡菜的生產(chǎn)過(guò)程中，由于蔬菜原料不容易滅菌，殘留的有害微生物常引起泡菜的腐敗變質(zhì)。“生花”是最常見(jiàn)的腐敗現(xiàn)象之一，泡菜一旦生花，不僅表面會(huì)出現(xiàn)白膜，而且會(huì)伴隨著餿臭味或腐敗味，菜品軟爛，泡菜汁渾濁。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)引起泡菜“生花”的微生物主要為酵母菌和芽孢桿菌，其中Pichia manshurica和Candida tropicalis在酸性條件下容易形成膜，是導(dǎo)致泡菜在貯藏過(guò)程中生花的主要微生物，而芽孢桿菌若在發(fā)酵前期污染嚴(yán)重，常導(dǎo)致泡菜樣品色變、湯汁渾濁，促進(jìn)生花現(xiàn)象的發(fā)生[1]。生產(chǎn)廠家常通過(guò)滅菌和添加防腐劑的辦法來(lái)控制腐敗菌的生長(zhǎng)。但是滅菌通常會(huì)使泡菜變軟，而添加防腐劑不僅會(huì)將乳酸菌部分殺死，而且會(huì)影響泡菜的整體風(fēng)味[2]。大多數(shù)學(xué)者都是通過(guò)外來(lái)添加物來(lái)抑制發(fā)酵蔬菜中生花腐敗菌的生長(zhǎng)，例如韓國(guó)的學(xué)者通過(guò)添加大蒜油來(lái)抑制韓國(guó)泡菜中酵母菌的產(chǎn)膜，美國(guó)的學(xué)者通過(guò)添加（E）-3-已烯酸和已酸來(lái)取代山梨酸抑制泡菜水中酵母菌的生長(zhǎng)[3-4]。而通過(guò)乳酸菌的生長(zhǎng)代謝抑制引起“生花”的腐敗菌的研究較少。

乳酸菌是引起泡菜良性發(fā)酵的主要微生物，在泡菜發(fā)酵過(guò)程中起著主導(dǎo)作用。優(yōu)良的乳酸菌可通過(guò)自身的生長(zhǎng)繁殖以及代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸、雙乙酰、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等）的作用來(lái)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)和代謝，而“生花”現(xiàn)象主要是腐敗菌在有氧條件下的代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致[4]，因此通過(guò)篩選具有抑制引起泡菜生花腐敗菌的乳酸菌菌株，可以控制泡菜生花現(xiàn)象的發(fā)生，改善產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)商品的貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌（7株） 分離自四川自然發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)泡菜樣品[6]，菌株編號(hào)分別為：SCP09（Lactobacillus brevis）、SCP15（L.plantarum）、SCP21（L.plantarum）、SCP27（L.fermentum）、SCP49（L.plantarum）、SCP53（L. plantarum）、SCP57（L.plantarum），NCBI登陸號(hào)為AB617645-AB617651；腐敗菌（4株） 1P-1、4P-2、3P-1、1P-2，經(jīng)菌種鑒定分別為Pichia manshurica、Candida tropicalis、Bacillus subtilis、Bacillus altitudinis[1]；PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基 用于腐敗真菌的活化、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)；NA（營(yíng)養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基 用于腐敗細(xì)菌的活化、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)；MRS培養(yǎng)基 用于乳酸菌的活化和培養(yǎng)；其余試劑 為分析純。

PYX-DHS-60×75型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；pH4-C+型酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SYQ-DSY-280B型高壓滅菌鍋 上海善志儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌上清液的制備 乳酸菌經(jīng)活化后，按0.1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，8000r/min，離心1min，取上清液備用[7]。

1.2.2 指示菌菌液制備 將供試腐敗菌反復(fù)三次接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中活化后，細(xì)菌和酵母菌均按0.1%的接種量分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌37℃，酵母菌28℃培養(yǎng)24h，調(diào)整菌體濃度為108CFU/mL備用。

1.2.3 抑菌圈的測(cè)定（牛津杯法） 將配制好的瓊脂空白培養(yǎng)基倒入滅菌的平板，每個(gè)10mL，待培養(yǎng)基凝固后；移取指示菌菌液至45℃的PDA（酵母菌）或NA（細(xì)菌）培養(yǎng)基，使菌液濃度為105CFU/mL，混勻，取15mL培養(yǎng)基倒入鋪有空白瓊脂的平板中。用鑷子將已滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6mm）放入平板對(duì)稱四個(gè)點(diǎn)上，用移液槍向牛津杯中加入乳酸菌上清液50μL，牛津杯中加入MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，細(xì)菌37℃，酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，記錄抑菌圈的大小。將抑菌能力較強(qiáng)的菌株用于后續(xù)抑菌效果和抑菌率的測(cè)定[8]。

1.2.4 乳酸菌上清液對(duì)腐敗菌抑菌效果的測(cè)定 將指示菌按照0.1%的接種量接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分裝5mL于滅菌的試管中，分別加入500μL各種乳酸菌上清液作為實(shí)驗(yàn)組，以加入MRS液體培養(yǎng)基的試管作為對(duì)照，28℃或37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察指示菌在試管中的生長(zhǎng)現(xiàn)象（產(chǎn)膜，混濁度，沉淀）。

抑菌率的測(cè)定：將觀察現(xiàn)象后的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10-2～10-6后，涂布于PDA或NA平板中，用于測(cè)定培養(yǎng)液指示菌的含量，以計(jì)算不同乳酸菌上清液對(duì)不同指示菌的抑菌率。抑菌率的計(jì)算公式[9]：

抑菌率（%）=（對(duì)照組指示菌菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組指示菌菌落數(shù)）/對(duì)照組指示菌菌落數(shù)×100

1.2.5 篩選出的乳酸菌在泡菜發(fā)酵過(guò)程中的抑菌能力 將篩選出的具有明顯抑菌作用的菌株與一種腐敗菌共同接種于自然發(fā)酵的泡菜樣品中，只接種腐敗菌的樣品作為對(duì)照，用于測(cè)試乳酸菌在泡菜環(huán)境中抑制相應(yīng)腐敗菌的能力。

操作流程：將新鮮水蘿卜清洗、晾干、切分之后稱重，每100g樣品加入150mL無(wú)菌水，加入總量4%的食鹽后，實(shí)驗(yàn)組接種乳酸菌和一種腐敗菌各103CFU/mL，對(duì)照組只接種相應(yīng)的腐敗菌103CFU/mL，密封。樣品于25℃條件下發(fā)酵1周。結(jié)果記錄主要包括生花程度、顏色、發(fā)酵液渾濁度。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯法測(cè)定乳酸菌對(duì)腐敗菌的抑制結(jié)果與分析

從表1乳酸菌對(duì)腐敗菌的抑制結(jié)果來(lái)看，供試7株乳酸菌對(duì)芽孢桿菌3P-1和1P-2抑菌效果較好，均能產(chǎn)生不同程度的抑制。乳酸菌SCP53和SCP27產(chǎn)生的抑菌圈最大，因此兩株菌能有效抑制供試腐敗芽孢桿菌的生長(zhǎng)，其次抑制效果較佳的為菌株SCP21。從對(duì)酵母菌1P-1和4P-2的抑制效果來(lái)看，多數(shù)乳酸菌對(duì)這兩株菌不具有抑制能力，只有乳酸菌SCP27和SCP53對(duì)其有一定的抑制能力，而SCP21只對(duì)4P-2有一定的抑制作用。

多數(shù)乳酸菌的抑菌能力來(lái)自于其產(chǎn)生的乳酸。產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌通常具有很好的抑制雜菌生長(zhǎng)的能力，尤其是對(duì)耐酸性不強(qiáng)的菌株。對(duì)于芽孢桿菌而言，雖然其生命力旺盛，不容易被徹底除去，但是其在酸性條件下的存活能力大大下降[10]。供試乳酸菌全為乳酸桿菌，都具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，尤其是植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力在乳桿菌中是較強(qiáng)的，是蔬菜發(fā)酵過(guò)程中最常用的菌株種類，所以體現(xiàn)出對(duì)芽孢桿菌較強(qiáng)的抑制效果。然而對(duì)于酵母菌而言，雖然供試的酵母菌分屬畢赤酵母屬和假絲酵母屬，但是都能在酸性條件下生存，是酸性產(chǎn)品中的主要腐敗微生物，能分解乙醇、乳酸、醋酸為二氧化碳和水，因此僅靠乳酸菌產(chǎn)酸是很難將酵母菌大量抑制的[11]。有些乳酸菌能產(chǎn)生H2O2、雙乙?；蛞志仡愇镔|(zhì)，可能對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

2.2 乳酸菌對(duì)腐敗菌在液體條件下生長(zhǎng)的抑制效果與分析

表1 牛津杯法測(cè)定乳酸菌對(duì)腐敗菌的抑制效果Table 1 The inhibition of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms by Oxford cup method

泡菜生花主要是腐敗微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的結(jié)果，泡菜一旦生花后，常表現(xiàn)出表面成膜、汁液渾濁、沉淀等現(xiàn)象。利用三株抑菌作用較強(qiáng)的乳酸菌用于測(cè)定在液體生長(zhǎng)狀態(tài)下對(duì)腐敗菌的抑制作用，從表2結(jié)果來(lái)看，乳酸菌上清液的加入對(duì)供試腐敗菌的產(chǎn)膜有較大程度的改善。乳酸菌SCP53對(duì)菌株1P-2和3P-1的產(chǎn)膜、沉淀、渾濁等現(xiàn)象都能有效抑制。對(duì)于菌株1P-1和4P-2，乳酸菌對(duì)其產(chǎn)膜有一定的抑制，其中乳酸菌SCP53的抑制效果最佳，4P-2無(wú)膜出現(xiàn)，但是1P-1還是有輕微的膜存在。因此，在液體條件下，腐敗芽孢桿菌受到乳酸菌代謝產(chǎn)物的影響，生長(zhǎng)代謝被抑制，腐敗現(xiàn)象明顯改善。然而腐敗的酵母菌因不能完全被抑制，所以還是會(huì)呈現(xiàn)出不同程度的產(chǎn)膜、沉淀以及渾濁的現(xiàn)象。

為了考察乳酸菌對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)量的抑制，測(cè)定了乳酸菌對(duì)腐敗菌的抑制率（表3）。從表3可以看出，SCP21上清液對(duì)3P-1抑制效果明顯，能抑制95.86%的菌株生長(zhǎng)；SCP27能明顯抑制菌株1P-2和3P-1的生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到99.85%和93.97%；SCP53對(duì)1P-2和3P-1的抑制率分別達(dá)到98.91%和99.45%。從百分比可得，三株乳酸菌對(duì)芽孢桿菌的抑制率都大于90%。從對(duì)酵母菌的抑制效果可得，SCP21對(duì)菌株1P-1和4P-2的抑菌率都較低，與表2中的現(xiàn)象相吻合。SCP27對(duì)兩株菌的抑菌率在50%左右，雖然腐敗菌數(shù)目減少了一半，但是仍然存在較大數(shù)量的菌株，因此在表2中腐敗菌在液體中仍會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)膜、沉淀、渾濁等現(xiàn)象。乳酸菌SCP53對(duì)菌株1P-1和4P-2的抑菌率分別為88.24%和76.47%，是三株乳酸菌中抑制酵母菌效果最好的菌株，在表2中也只是在1P-1試管中出現(xiàn)輕微長(zhǎng)膜的現(xiàn)象，但是由于仍有部分菌體殘留，所以液體仍然具有一定的渾濁度。因此酵母菌的數(shù)量對(duì)泡菜樣品是否產(chǎn)膜以及渾濁度具有較高的相關(guān)性，數(shù)量越高，生花的程度以及液體的渾濁度越嚴(yán)重。

2.3 乳酸菌在泡菜發(fā)酵過(guò)程中的抑菌效果測(cè)定結(jié)果與分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCP53對(duì)腐敗菌在泡菜發(fā)酵過(guò)程中的抑菌效果，將其與腐敗菌共同接種用于蘿卜泡菜的發(fā)酵。從圖1中可以直觀的看出，第一排只接種腐敗菌的樣品均出現(xiàn)不同程度的長(zhǎng)膜、汁液渾濁、顏色劣變現(xiàn)象。從成膜的現(xiàn)象來(lái)看，接種1P-1菌株的泡菜樣品表現(xiàn)出了嚴(yán)重的生花情況，發(fā)酵液表面出現(xiàn)一層厚厚的皺褶膜，泡菜汁液變渾濁，其次為4P-2表面一層明顯的白膜，泡蘿卜顏色變白，汁液也較渾濁。3P-1有零星的明顯的膜，泡菜顏色褐變。1P-2接種的樣品顏色正常，但是也出現(xiàn)零星的生花現(xiàn)象。而下排與乳酸菌SCP53共同接種以后，泡菜品質(zhì)均得到改善。生花最嚴(yán)重的1P-1產(chǎn)膜的現(xiàn)象得到明顯控制，只出現(xiàn)零星的膜，顏色也得到較大改善；接種4P-2的樣品生花現(xiàn)象得到控制，湯汁較清亮；接種3P-1的樣品雖然仍存在褐變的現(xiàn)象，但是無(wú)生花和湯汁渾濁的情況。而對(duì)于接種1P-2的樣品，不良現(xiàn)象幾乎都被全部抑制，泡菜顏色非常鮮亮，湯汁澄清透明。結(jié)果表明：乳酸菌SCP53接種于發(fā)酵泡菜中能較好地抑制泡菜中生花腐敗菌的生長(zhǎng)，可單獨(dú)或配合其他乳酸菌用于直投式泡菜菌種的制作。

圖1 在泡蘿卜中乳酸菌SCP53對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.1 The inhibition of SCP53 to spoilage microorganism in radish pickle

表2 乳酸菌對(duì)腐敗菌在液體條件下生長(zhǎng)的抑制效果Table 2 The inhibiton of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms in liquid

表3 添加不同乳酸菌上清液對(duì)腐敗菌的抑制率測(cè)定結(jié)果Table 3 Inhibition rate of LAB supernatant fluid to spoilage microorganisms

3 討論

由于生產(chǎn)泡菜的蔬菜原料通常不會(huì)通過(guò)滅菌處理，因此泡菜經(jīng)發(fā)酵后殘留的腐敗微生物在合適的條件下就容易出現(xiàn)生花、顏色退變、變軟等腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象[8]。篩選具有針對(duì)性抑菌能力的乳酸菌用于泡菜菌種的制作對(duì)發(fā)酵型泡菜的品質(zhì)保證具有較好的作用。

筆者在論文的實(shí)施過(guò)程中并沒(méi)有采用直接將乳酸菌和腐敗菌接種到泡菜中的方式來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要目的是為了排除原料中帶有的微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。通過(guò)平板和試管中的結(jié)果來(lái)進(jìn)行篩選，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

供試的乳酸菌中有5株均為植物乳桿菌，菌株在產(chǎn)酸能力上并不存在太大的差異，而只有SCP53表現(xiàn)出了明顯的抑制酵母菌生長(zhǎng)代謝的能力，說(shuō)明該菌株的代謝產(chǎn)物中可能含有細(xì)菌素類物質(zhì)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)接種乳酸菌和腐敗微生物發(fā)酵的泡菜樣品進(jìn)行結(jié)果觀察時(shí)，主要針對(duì)生花、顏色以及湯汁的渾濁程度來(lái)進(jìn)行了驗(yàn)證。本應(yīng)該對(duì)泡菜樣品進(jìn)行品嘗，分析其對(duì)滋氣味的變化，但是由于接種了一定量的腐敗菌，出于安全的考慮未進(jìn)行分析。后續(xù)我們還將通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀、氣相色譜、電子鼻等設(shè)備對(duì)接種腐敗菌以及接種SCP53后對(duì)泡菜的質(zhì)構(gòu)及滋氣味的變化進(jìn)行進(jìn)一步的分析和討論。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)比不同乳酸菌上清液對(duì)四株腐敗菌在平板以及發(fā)酵液中的抑菌效果，篩選出對(duì)供試腐敗菌都具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌SCP53用于與腐敗菌共同接種發(fā)酵蘿卜泡菜。通過(guò)與只接種腐敗菌的樣品相比，菌株SCP53能有效抑制腐敗菌產(chǎn)膜、變色、使汁液渾濁等現(xiàn)象，可用于直投式泡菜菌種的開發(fā)。

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Screening Lactobacillus to inhibit spoilage microorganism isolated from film-forming pickle

AO Xiao-lin1，PU Biao1，CAI Yi-min2，CHEN Cen1，HU Ai-hua1，CHEN An-jun1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625000，China；2.Japan International Research Center for Agricultural Sciences（JIRCAS），Ibaraki 305-8686，Japan）

Seven lactic acid bacteria strains isolated from high-quality pickle samples were screened to inhibit four kinds of spoilage microorganisms，which caused the pickle film.Lactobacillus plantarum SCP53，which had strong antimicrobial activity to tested spoilage microorganisms，was selected by oxford cup method and liquid culture（film，precipitation，liquid turbidity，and inhibition rate to spoilage microorganisms）.SCP53 and spoilage microorganisms were inoculated to make radish pickle，and the results indicated that SCP53 could prevent the formation of film and improved the quality of pickle.

pickle；lactic acid bacteria；spoilage microorganism；antimicrobial activity；screening

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0234-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.043

2014－03－25

敖曉琳（1979-），女，博士，講師，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171726）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012NZ0002）。