一種羊酸奶發(fā)酵劑的富硒工藝研究

張海濤，牛 林，淡瑞芳（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

一種羊酸奶發(fā)酵劑的富硒工藝研究

張海濤，牛 林，淡瑞芳*
（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

以菌體中含硒量為指標(biāo)，確定加硒和富硒培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、菌種接種比例，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)加硒濃度、接種量、培養(yǎng)pH和低聚果糖添加量4個(gè)較為重要的富硒因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)確定加硒時(shí)間為菌體培養(yǎng)開始后24h，富硒培養(yǎng)時(shí)間60h，培養(yǎng)溫度41℃，長(zhǎng)雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌按2∶1混合培養(yǎng)。以菌體含硒量為考察指標(biāo)，獲得最佳發(fā)酵條件為：混合菌接種量3%，硒的質(zhì)量濃度8μg/g，低聚果糖質(zhì)量濃度1.00%，pH6.5，此時(shí)酸奶發(fā)酵劑中硒含量約33.46μg/kg。

羊酸奶，發(fā)酵，富硒條件，優(yōu)化

硒（selenium）是人體所必需的微量元素[1]，它對(duì)人體的正常代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。缺硒可能導(dǎo)致癌癥和心肌梗塞等多種疾病的發(fā)生，通過(guò)膳食攝取足夠的硒，可起到預(yù)防有關(guān)疾病的作用[2-3]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦正常人體硒攝入量為60～200μg/d。根據(jù)我國(guó)13省市營(yíng)養(yǎng)調(diào)查報(bào)告結(jié)果，調(diào)查區(qū)域內(nèi)普遍存在硒攝入量不足的問(wèn)題，成人每日人均硒攝入量?jī)H為26.36μg[4]。按照形態(tài)分類，硒可分為有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒兩種，但無(wú)機(jī)硒毒性高，而有機(jī)硒具有吸收利用率高并且且副作用小的優(yōu)點(diǎn)，所以硒的生物轉(zhuǎn)化是一條安全有效的途徑[5]。研究表明乳酸菌具有優(yōu)良的富硒能力[6-7]，是一種有機(jī)硒的良好來(lái)源。隨著硒對(duì)人體的功效認(rèn)識(shí)的逐漸深入，開發(fā)富硒產(chǎn)品已引起各方面的重視，特別是開發(fā)富硒保健食品，針對(duì)各種由于缺硒而帶來(lái)的疾病預(yù)防具有非凡的意義。

羊奶富含蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)元素，具有多種保健功能、易于吸收，是世界上公認(rèn)的最接近人奶的奶品，也是現(xiàn)代人類健康的“營(yíng)養(yǎng)佳品”[8]，但羊奶硒含量低于牛奶，因此，利用羊奶開發(fā)富硒酸奶，可以更好發(fā)揮羊乳的保健功能，推進(jìn)羊乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，起到積極的作用。本文以長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌作為發(fā)酵菌種，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)依次考察影響菌體含硒量的各個(gè)因素，選取較優(yōu)的水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以硒含量為考察指標(biāo)確定出富硒羊酸奶的主要發(fā)酵劑生產(chǎn)工藝，以期為富硒羊酸奶的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)雙歧桿菌lb05 上海信然生物技術(shù)有限公司；嗜酸乳桿菌sl05 江蘇沃爾德實(shí)業(yè)有限公司；蛋白胨（生化試劑） 湖北輝華生物有限公司；牛肉浸粉（生化試劑） 上?？婆d生化試劑有限公司；酵母浸膏（生化試劑） 宜興市江山生物制劑有限公司；亞硒酸鈉（食品級(jí)） 鄭州錦德化工有限公司。

NDJ-7粘度計(jì) 深圳市恒盛豐工貿(mào)有限公司；Forma1029厭氧培養(yǎng)系統(tǒng) 北京晨時(shí)科儀商貿(mào)有限公司；SKD-600自動(dòng)凱氏定氮儀 南京創(chuàng)睿儀器儀表有限公司；DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱 常州市偉嘉儀器制造有限公司；PHS-3cpH儀 深圳市卡迪亞科技有限公司；KXX-5-12馬弗爐 上虞市鑫達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；FD-IB-50冷凍干燥機(jī) 臺(tái)灣臺(tái)大電子（東莞）有限公司；MARK MW3系列電子天平 鉑悅儀器（上海）有限公司；DZF-6021真空干燥箱 上海杰偉福電子商務(wù)有限公司；SW-CJ-1F雙面凈化工作臺(tái) 上海康路儀器設(shè)備有限公司；MWCO3500透析袋 上海源葉生物科技有限公司；羅茲哥特里抽脂瓶 北京朋利馳科技有限公司；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 液體MRS培養(yǎng)基 蛋白陳10g、牛肉浸粉8g、酵母浸膏9g、葡萄糖20g、KH2PO 2g、檸檬酸氫二銨2g、CH3COONa 5g、MgSO40.2g、MnSO40.04g、Tween 80mL、蒸餾水1000mL，pH為5.7±0.2，121℃滅菌20min；液體MRS改良培養(yǎng)基：于MRS液體培養(yǎng)基中添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽121℃滅菌20min；固體MRS培養(yǎng)基 于MRS液體培養(yǎng)基中添加14g的瓊脂，121℃滅菌20min；MRS-raffinose：在MRS固體培養(yǎng)基中添加1%的棉籽糖、0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和0.05% LiCl于121℃滅菌20min；全脂羊乳培養(yǎng)基 復(fù)原羊乳92%、蔗糖6%、低聚異麥芽糖1%、酪蛋白酸鈉1%、Na2SeO340μg/kg，108℃滅菌20min。

1.2.2 混合菌體富硒培養(yǎng)方法 配制一定濃度亞硒酸鈉溶液，滅菌待用。在無(wú)菌操作條件下，按照一定比例將亞硒酸鈉溶液加至改良液體MRS培養(yǎng)基中，搖勻，接入長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05。在37℃下培養(yǎng)72h，然后將混合菌體培養(yǎng)物在4℃，10000r/min條件下，離心10min，棄上清液，用去離子水洗滌3次，置于真空干燥箱中干燥（50℃，-0.1MPa）至恒重，得混合菌體。

1.2.3 菌體有機(jī)硒含量的測(cè)定 取1g富硒發(fā)酵劑加入截留分子質(zhì)量為3500u透析袋中，并置于去離子水中透析至無(wú)硒析出時(shí)，說(shuō)明無(wú)機(jī)硒已經(jīng)全部析出，再將其在4℃，10000r/min條件下，離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，60℃干燥至恒重，然后參考石墨爐原子吸收法測(cè)定[9]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 益生菌富硒條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 不同硒濃度對(duì)菌體富硒效果的影響 配制硒酸鈉含量分別為2、4、6、8、10μg/g培養(yǎng)基，測(cè)定lb05、sl05純菌種和lb05∶sl05為1∶1混合菌種在37℃條件下，發(fā)酵50h后的菌體硒含量。

1.2.4.2 加硒時(shí)間對(duì)菌體富硒效果的影響 采用lb05∶sl05為1∶1混合菌種，分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32h添加亞硒酸鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基硒含量為6μg/g，測(cè)定在37℃條件下，發(fā)酵50h后的菌體硒含量。

1.2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體富硒效果的影響 采用lb05∶sl05為1∶1混合菌種，發(fā)酵6h后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基硒含量為6μg/g，分別培養(yǎng)36、48、60、72、84h后，測(cè)定菌體硒含量。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度和初始pH對(duì)菌體含硒量的影響 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH分別為5.0、6.0、7.0，分別在33、35、37、39、41、43℃的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)60h，測(cè)定菌體硒含量。1.2.4.5 接種比例和接種量對(duì)菌體含硒量的影響 按照長(zhǎng)雙歧桿菌：嗜酸乳桿菌=1∶1、2∶1、3∶1、2∶3、1∶2比例進(jìn)行對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)配，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.0，按照體積分?jǐn)?shù)的1%、2%、3%、4%、5%接種，在41℃條件下培養(yǎng)60h，測(cè)定菌體硒含量。

1.2.4.6 低聚糖及其含量對(duì)菌體含硒量的影響 液體改良MRS培養(yǎng)基中等量的葡萄糖分別按照0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的比例以低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚異麥芽糖代替，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6.0，添加復(fù)合菌種（lb05∶sl05=2∶1）3%，在41℃條件下培養(yǎng)60h，測(cè)定菌體硒含量。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化益生菌的富硒條件 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取接種量、硒濃度、pH及低聚果糖添加量進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，制作發(fā)酵羊酸奶發(fā)酵劑，以羊酸奶發(fā)酵劑中硒含量作為考察指標(biāo)。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test factors L9（34）

1.2.6 液態(tài)及固態(tài)富硒羊酸奶發(fā)酵劑的制備 收集長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合富硒培養(yǎng)產(chǎn)物，將其置于50mL無(wú)菌離心管內(nèi)，10000r/min，4℃冷凍離心10min。取一定量的預(yù)先經(jīng)過(guò)108℃滅菌20min的10%脫脂復(fù)原羊乳，沖洗菌體并稀釋至約4×108cfu/mL濃度，制備得液態(tài)富硒羊酸奶發(fā)酵劑。制備所得液態(tài)發(fā)酵劑置于-80℃低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍2h，以冷凍溫度-50℃，真空度20Pa，真空冷凍干燥約48h，即得固態(tài)富硒羊酸奶發(fā)酵劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒濃度對(duì)菌體含硒量的影響

不同硒濃度對(duì)菌體含硒量的影響如圖1所示，硒濃度在2～10μg/g范圍內(nèi)，長(zhǎng)雙歧桿菌lb05、嗜酸乳桿菌sl05及其混合（1∶1）菌體中含硒量均先上升，后增加不顯著，其中混合菌種富硒效果顯著，在加硒濃度為6μg/g時(shí)，混合菌種富硒效果最佳，菌體含硒量為532μg/g，含量最高。因此，選擇以長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05按1∶1的混合比例培養(yǎng)富硒。在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中以6μg/g為中間值進(jìn)一步優(yōu)化最適的硒濃度值。

2.2 加硒時(shí)間對(duì)菌體含硒量的影響

加硒時(shí)間對(duì)菌體含硒量的影響如圖2所示，長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合富硒培養(yǎng)后24h時(shí)加硒，菌體中含硒量達(dá)最高值488μg/g，這是由于生長(zhǎng)階段不同，微生物對(duì)硒的吸收利用率也不同[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)至24h加硒效果最理想，實(shí)驗(yàn)所用菌株種類不同，菌株的性質(zhì)決定了在菌株的不同生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)化的硒能力有差別，所以加硒時(shí)間有先后差異。

圖1 不同硒質(zhì)量濃度對(duì)菌體含硒量的影響Fig.1 Content of selenium in cells with different concentration of the selenium

圖2 不同加硒時(shí)間下菌體含硒量Fig.2 Content of selenium in cells in different selenium-added time

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體含硒量的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間下菌體含硒量影響如圖3所示，長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合培養(yǎng)36～60h時(shí)，菌體含硒量呈上升趨勢(shì)，而在60～84h范圍內(nèi)，菌體中含硒量呈下降趨勢(shì)。因此，適宜的培養(yǎng)時(shí)間為60h。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間下菌體含硒量Fig.3 Different cell culture time selenium content

2.4 發(fā)酵溫度和初始pH對(duì)菌體含硒量的影響

發(fā)酵溫度和初始pH對(duì)菌體含硒量的影響如圖4所示，在37～41℃范圍內(nèi)，菌體含硒量隨溫度上升而增加，而大于41℃時(shí)呈下降趨勢(shì)。此外，pH為6.0時(shí)，菌體中硒含量（518μg/g）明顯高于pH5.0和pH7.0時(shí)的硒含量（分別為498μg/g和486μg/g）。因此，選擇適宜的富硒培養(yǎng)溫度為41℃，pH為6，并在后面的正交實(shí)驗(yàn)中以6.0為中間值進(jìn)一步優(yōu)化最適發(fā)酵pH。

圖4 不同溫度和pH下菌體含硒量Fig.4 Content of celenium in cells under different innital pH and culture temperature

2.5 接種比例和接種量對(duì)菌體含硒量的影響

接種比例和接種量對(duì)菌體含硒量的影響如圖5所示，當(dāng)接種量從1%升至3%時(shí)，不同混合比例的菌體含硒量隨接種量增加而呈上升趨勢(shì)。而從3%進(jìn)一步升到5%時(shí)，接種比（菌株lb05∶sl05）為1∶1、2∶1、2∶3和1∶2的菌體含硒量增加量均不顯著，所有組別中的高峰值出現(xiàn)在接種量為3%時(shí)，其中接種比例為2∶1時(shí)，此時(shí)菌體含硒量達(dá)到548μg/g，次高峰值為同組的1∶1比例混合樣，菌體含硒量為530μg/g。因此，確定長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05混合比例為2∶1，并在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中以3%接種比例為中間值進(jìn)一步優(yōu)化最佳的接種量。

圖5 不同接種比例與接種量下菌體含硒量Fig.5 Content of selenium in cells with different inoculation ratio and amount

2.6 低聚糖及其含量對(duì)菌體含硒量的影響

低聚糖及其含量對(duì)菌體含硒量的影響如圖6所示，添加低聚糖能不同程度地促進(jìn)兩種乳酸菌的富硒能力。其中以低聚果糖的作用最為顯著，在其添加量為1%時(shí)，菌體含硒量可高達(dá)530μg/g。作為乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中主要的“食物來(lái)源”（即通常所稱的“益生元”），低聚果糖、木糖、異麥芽糖等因?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)上的差異，使得這些益生菌在將其分解，獲取能量上的效率不同，生長(zhǎng)速度上也不同，導(dǎo)致最終的菌體含硒量出現(xiàn)較大差距[12]。在后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)中，將以1%作為中間值，進(jìn)一步研究低聚果糖的最優(yōu)添加量。

圖6 不同低聚糖及其含量下的菌體含硒量Fig.6 Content of selenium in cells with different oligo and content

2.7 羊酸奶發(fā)酵劑富硒條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重點(diǎn)選取接種量、硒濃度、pH及低聚果糖添加量進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。制作羊酸奶發(fā)酵劑，以羊酸奶發(fā)酵劑中的含硒量作為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)以“羊酸奶發(fā)酵劑含硒量”作為考察指標(biāo)時(shí)，最佳的水平組合為A2B3C3D2。即混合菌接種量3%，硒的質(zhì)量濃度8μg/g，pH6.5，低聚果糖質(zhì)量濃度1%。按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)酸奶發(fā)酵劑中平均硒含量為33.46μg/g。

表2 接種量、硒濃度、pH及低聚果糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Inoculation,selenium concentration，pH and oligofructose orthogonal test results

3 結(jié)論

通過(guò)研究了加硒濃度、加硒時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵初始pH、接種量、各菌株混合比例、添加的低聚糖種類和濃度等工藝條件對(duì)羊酸奶中含硒量的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酸奶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵條件為：混合菌接種量3%，硒的質(zhì)量濃度8μg/g，pH6.5，低聚果糖質(zhì)量濃度1%。此時(shí)酸奶發(fā)酵劑中硒含量約33.46μg/kg。說(shuō)明長(zhǎng)雙歧桿菌lb05和嗜酸乳桿菌sl05具有良好地富硒能力，發(fā)酵的羊酸奶能很好的補(bǔ)充人體硒元素，為富硒羊酸奶發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。

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Study on the fermentation condition of Goat yogurt for selenium-enriched

ZHANG Hai-tao，NIU Lin，DAN Rui-fang*
（Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China）

The impact of the different fermentation conditions was studied on selenium-enriched of the fermentated goat yogurtionthrough single factor screening and orthogonal experimental.The temperature，culture time of selenium-enriched，incubation temperature and the proportion of inoculation was determined by using selenium content in the bacteria as the index.The fourimportant factors including selenium concentration，inoculum size，culture pH and the added amount of oligofruc to selenium were optimized through orthogonal test.The results showed that the single-factor test to selenium was riched after 24 hours of bacteria cultivation，incubated for 60h at 41℃ with ratio of Bifidobacterium longum，Lactobacillus acidophilus 2∶1 mixed culture through single-factor test.The orthogonal test was done according to the selenium content as the index.The best fermentation conditions were as follow：mixed inoculum of 3%，selenium concentration of 8μg/g，pH6.5，and 1.00%fructo-oligosaccharides by selenium content in yogurt as the main index.The selenium content of goat yogurtion was 33.46μg/kg.

Goat yogurt；fermentation；selenium-enriched；optimization

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.041

2013-09-13 *通訊聯(lián)系人

張海濤（1974-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。