多級溶劑萃取-氣相色譜測定羊奶中致膻游離脂肪酸

楊春杰，丁　武，馬利杰（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

多級溶劑萃取-氣相色譜測定羊奶中致膻游離脂肪酸

楊春杰，丁武*，馬利杰
（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

目的：建立了多級溶劑萃取-氣相色譜測定羊奶中致膻游離脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸）的方法。方法：樣品經過氯仿-甲醇（2∶1，v/v）溶液、碳酸鈉堿性溶液多級溶劑萃取濃縮，并經三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w）酯化后，用配備氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜測定。結果：己酸、辛酸、癸酸的線性范圍分別為5.11～163.52、5.05～161.73和7.54～241.38mg/L，決定系數R2均大于0.998；三種游離脂肪酸的檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內；加標回收率分別為88.5%、91.9%和103.4%，方法相對標準偏差為1.98%～6.09%。結論：本方法經濟、準確、靈敏度高，適用于液態(tài)奶產品中這幾種游離脂肪酸的檢測。

多級溶劑萃取，甲酯化，氣相色譜，游離脂肪酸，羊奶

羊奶營養(yǎng)價值豐富，全世界年產量達2200多萬噸，但是大部分消費者不適應其存在的獨特風味—膻味，限制了羊奶業(yè)消費人群的發(fā)展[1-3]。羊奶中含有3%左右的脂質（主要是甘油三酯），游離脂肪酸（FFA）含量少，穩(wěn)定性較差[4]。羊奶中的游離脂肪酸，特別是游離己酸、辛酸和癸酸對膻味的形成起顯著作用[5]，這些游離脂肪酸的含量超過一定濃度，這種膻味就會加強[6]。因此，這幾種游離脂肪酸的檢測對羊奶膻味的研究與控制十分重要。

國際上一直沒有奶中游離脂肪酸的標準測定方法，目前常用的分析方法是氣相色譜法，如固相萃取-氣相色譜[7-11]、固相微萃取-氣相色譜[12-14]和毛細管電泳[15]等。固相萃取-氣相色譜對萃取柱、洗脫液選擇要求較高；固相微萃取-氣相色譜的檢測對象是密封奶樣的頂空平衡氣，未能準確反映奶樣中FFA含量，特別是長鏈不揮發(fā)游離脂肪酸的含量。同時，這兩種方法大都需要配備專門的萃取設備，且萃取柱專一性強、易損耗、價格偏高。毛細管電泳法雖然步驟簡單，但檢測限偏高。多級溶劑萃取技術結合氣相色譜測定游離脂肪酸的方法簡單、經濟，目前該方法只是在酒類，如黃酒、啤酒游離脂肪酸的檢測中有所應用[16-17]，同時相關研究未對萃取溶劑做進一步優(yōu)化選擇。本研究擬采用優(yōu)化的多級溶劑萃取出游離脂肪酸，然后用氣相色譜定量測定這三種游離脂肪酸，以期建立一種簡單、經濟的液態(tài)奶產品中游離脂肪酸的檢測方法，為奶產品風味品質特別是羊奶膻味控制研究提供技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羊奶取自西北農林科技大學西農薩能奶山羊原種場畜牧基地，經65℃下殺菌30min后于4℃密封貯藏；己酸（C6∶0，純度≥99.5%）、辛酸（C8∶0，純度≥99.5%）、癸酸（C10∶0，純度≥99.5%）和壬酸（C9∶0，內標，純度≥99.5%）標準品阿拉丁公司；三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w） 德國CNW公司；正己烷（色譜純） 阿拉丁公司；氯仿、甲醇、無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、碳酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉均為市售分析純；水雙蒸水。

GC-2014C氣相色譜儀配有FID檢測器日本島津公司；BT25S分析電子天平德國Sartorius公司；旋口玻璃管美國Hach公司；移液槍10～100μL、100～1000μL，德國Eppendorf公司。

1.2實驗方法

1.2.1內標溶液的制備準確稱取壬酸20.00mg，用無水乙醇定容至100mL，配制成200.00mg/L的內標溶液。

1.2.2工作標準貯備溶液準確稱取己酸50.00mg、辛酸50.00mg、癸酸75.00mg于一旋口玻璃管，加入三氟化硼甲醇溶液2mL，80℃水浴酯化20min，冷卻后加入1mL飽和氯化鈉溶液，2mL正己烷萃取5次，收集有機相并用正己烷定容至25mL，得到混合標準母液；準確稱取壬酸（內標）50.00mg置于一旋口玻璃管，如上述酯化、萃取處理后定容至25mL，得到2000.00mg/L的內標母液；分別吸取混合標準母液25、50、100、200、300、400、500、600、700和800μL，各加入500μL的內標母液，正己烷定容至10mL，得到一系列不同濃度混和標準品溶液，按濃度從小到大依次編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。以上標準溶液于-40℃密封保存，使用時稀釋配制。

1.2.3色譜條件色譜柱：DB-17石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；檢測器：FID；載氣：高純氮氣；進樣口溫度：260℃；檢測器溫度：280℃；色譜柱升溫程序：初始溫度120℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持15min；柱前壓（載氣N2為100kPa，H2為75kPa，空氣為50kPa）；進樣量：2μL；分流比為1∶5。

1.2.4樣品制備取10mL羊奶置于50mL旋口離心管，加入500μL內標溶液、2g NaCl，混勻后加入1mL 2.5mol/L的H2SO4溶液。用25mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）連續(xù)萃取兩次，每次1.5h，收集有機相。有機相用5mL 50g/L的Na2CO3溶液連續(xù)萃取3次，收集水相。水相用5mol/L的HCl溶液調節(jié)pH至2.0，然后用5mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）連續(xù)萃取3次，收集有機相。有機相經無水硫酸鈉脫水后移入旋口玻璃管。氮吹濃縮到約0.5mL，加入1mL三氟化硼甲醇（14%，w/w）溶液，密封后于80℃水浴酯化20min。冷卻后加入1mL飽和NaCl溶液、1mL正己烷，收集有機相至進樣瓶待分析。

1.2.5樣品的測定和計算根據保留時間進行定性，根據相對質量校正因子進行定量。樣品中各游離脂肪酸含量計算公式：

式中：ci：樣品中游離脂肪酸i的含量（mg/L）；Ai：樣品中游離脂肪酸i的峰面積；As：樣品中內標的峰面積；fsi：相對質量校正因子；cs：樣品中內標物的含量（mg/L）。

2　結果與分析

2.1萃取溶劑的選擇

常用的脂類萃取溶劑有乙醚-石油醚[7，18]、正己烷-二氯甲烷[16]、氯仿-甲醇[19]。本研究參照相關研究選定四種溶劑組合：正己烷-二氯甲烷（2∶1，v/v）、乙醚-石油醚（1∶1，v/v）、乙醚-正己烷（1∶1，v/v）、氯仿-甲醇（2∶1，v/v），比較其對游離己酸、辛酸和癸酸的提取效果。結果發(fā)現(xiàn)，正己烷-二氯甲烷和氯仿-甲醇溶劑組合對羊奶中這三種游離脂肪酸的提取效果較好（見圖1）。正己烷-二氯甲烷在萃取過程容易乳化，分層不明顯，使得平行組之間偏差較大，氯仿-甲醇能提取出結合態(tài)脂類，對游離己酸的提取效率高，萃取過程不易乳化[20]，因此選擇氯仿-甲醇（2∶1，v/v）為萃取溶劑。

圖1　不同萃取溶劑的提取效果Fig.1　Extraction efficiency of different solvents

2.2脂肪酸甲酯萃取過程有機溶劑的選擇

脂肪酸甲酯常用的萃取溶劑有正己烷、氯仿，本研究比較了這兩種溶劑對所測脂肪酸甲酯的提取效果。正己烷、氯仿對這三種脂肪酸甲酯的提取效果差異不明顯，但是氯仿組在色譜測定時溶劑有拖尾現(xiàn)象（見圖2），這可能和氯仿具有一定能力的吸水性相關，水分還會對實驗所用色譜柱有一定的損害作用。因此，選定正己烷（色譜級）作為萃取脂肪酸甲酯的有機溶劑。

2.3方法的專屬性

羊奶樣品與標準品溶液脂肪酸甲酯的保留時間一致，各脂肪酸甲酯的分離效果良好，雖然己酸甲酯主峰前后有色譜峰出現(xiàn)，但與主峰能實現(xiàn)基線分離，羊奶樣品中的內源性物質及其它雜質不干擾樣品的分離測定。該方法在羊奶樣品中還能檢測到另外9種游離脂肪酸（見圖3）。

表1　線性關系和檢出限分析Table 1　Linear relationship and detection limit of the three kinds of free fatty acids

圖2　正己烷（A）和氯仿（B）萃取脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2　Chromatograms of FAMEs extracted by hexane（A）and chloroform（B）

2.4線性關系及檢出限

取配好的混和標準品稀釋液，由低向高濃度連續(xù)進樣。以分析物的濃度為橫坐標，峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，進行線性回歸。

取混和標準品稀釋液（標號1）分別進行系列梯度稀釋測定，以信噪比（S/N）為3時標準品的濃度計算檢出限，信噪比（S/N）為10時標準品的濃度計算定量限。

在測定濃度圍內，F(xiàn)ID響應值與被測組分的線性關系良好，決定系數均在0.998以上；三種游離脂肪酸的檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內（見表1）。

2.5回收率

空白奶樣分別加入三個不同濃度的己酸、辛酸、癸酸標準品溶液（加標量見表2），每個濃度做3個平行，同時做6個空白奶樣（標號1#、2#、3#、4#、5#、6#）。按確定方法進行處理、測定。根據實際加標量和測定加標量計算回收率。

圖3　標準品溶液（A）和奶樣（B）的色譜圖Fig.3　Chromatograms of standards（A）and goat milk（B）

己酸的平均回收率為88.5%，RSD＜5.00%；辛酸的平均回收率為91.9%，RSD＜6.00%；癸酸的平均回收率為103.4%，RSD＜6.50%，表明在所選擇的方法和條件下，三種游離脂肪酸在所選加標濃度下均有較高且穩(wěn)定的回收率（見表2）。

表2　回收率實驗結果Table 2　Recovery of the three kinds of free fatty acids

2.6方法重復性

表3　重復性實驗Table 3　Repeatability of the three kinds of free fatty acids

按確定方法處理測定6個平行空白奶樣（1#、2#、3#、4#、5#、6#），計算各游離脂肪酸濃度的相對標準偏差。己酸、辛酸濃度的RSD＜5.00%，癸酸濃度的RSD＜7.00%，表明該方法重復性較好（見表3）。

2.7日內日間精密度

取高中低3種濃度的混和標準品稀釋液（混標液2、6、10），在1d內連續(xù)進樣6次。連續(xù)測定5d，計算峰面積的相對標準偏差。各峰面積日內RSD＜5.00%，日間RSD＜6.00%，表明建立的氣相色譜分析方法穩(wěn)定可靠（見表4）。2.8脂肪酸衍生產物（脂肪酸甲酯）溶液穩(wěn)定性

表4　精密度分析Table 4　Precision of intra-day and inter-day assay

將一份奶樣按確定方法制備好后（奶樣5#），在常溫下0、4、8、12h進樣測定，然后-40℃下保存，1～5d內每天測定一次，根據各脂肪酸甲酯對應的峰面積變化評價其穩(wěn)定性。各脂肪酸甲酯的日內RSD及日間RSD均小于10%，表明所測各游離脂肪酸預處理后的衍生產物（脂肪酸甲酯）樣品在常溫下保存12h，-40℃下密封保存5d仍保持穩(wěn)定，均未發(fā)生明顯的變化（見表5）。

2.9樣品測定

采用本方法對羊奶和單菌種在相同發(fā)酵條件下制得的酸羊奶共6個樣品進行檢測。結果表明，發(fā)酵后的羊奶中，游離己酸、辛酸、癸酸明顯增加，這和Guler Z，Regula A等的研究相符[7，9]，但各乳酸菌發(fā)酵后的酸羊奶膻味均有不同程度的減弱，可能是發(fā)酵過程產生的乙醛、雙乙酰（丁二酮）等有益風味物質對膻味起了一定的掩蔽作用。另外，不同乳酸菌對三種游離脂肪酸含量的影響存在差異（見表6）。

3　結論

本實驗建立了測定羊奶中游離己酸、辛酸、癸酸的多級溶劑萃取-氣相色譜方法。該方法對分析與羊奶中與膻味密切相關的游離己酸、辛酸、癸酸的專屬性好，檢出限和定量限分別在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范圍內，重復性好（RSD均小于10%），回收率在88.5%～103.4%范圍，適用于對液態(tài)奶產品中這三種游離脂肪酸的分析。本方法還檢測到其他9種游離脂肪酸，但對這些脂肪酸的定量檢測適用性還待進一步研究。

表6　樣品中游離脂肪酸檢測結果Table 6　Determination results of the FFAs in the samples

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Determination of the free fatty acids responsible for goaty flavor using multilevel solvent extraction-gas chromatography

YANG Chun-jie，DING Wu*，MA Li-jie
（College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

Objective：A method for the simultaneous determination of the free fatty acids（FFA）in goat milk such as caproic acid，caprylic acid and decanoic acid，which were responsible for goaty flavor，was developed by multilevel solvent extraction-gas chromatography.Methods：Extractions were carried out with chloroform/ methanol（2∶1，v/v）and sodium carbonate solution.The fatty acid methyl esters（FAMEs）which were obtained by the esterification of the FFA with boron trifluoride-methanol solution was qualified and quantified by gas chromatography equipped with flame ionization detector.Results：Over the concentration in the range of 5.11～163.52mg/L for caproic acid，5.05～161.73mg/L for caprylic acid and 7.54～241.38mg/L for decanoic acid，the coefficients of the calibration curves were above 0.998.The limits of detection（LOD）were 0.16mg/L for caproic acid，0.19mg/L for caprylic acid and 0.25mg/L for decanoic acid.The limits of quantification（LOQ）were 0.54mg/L for caproic acid，0.63mg/L for caprylic acid and 0.83mg/L for decanoic acid.The average recoveries of the three kinds of FFA ranged from 88.5%to 103.4%with relative standard deviations（RSDs）between 1.98%and 6.09%.Conclusion：The method was economical，accurate，and sensitive，which may be used for determination of the FFAs in milk.

solvent extraction；methylation；gas chromatography；free fatty acid；goat milk

TS252.7

A

1002-0306（2014）14-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.005

2013－10－09*通訊聯(lián)系人

楊春杰（1985-），男，碩士研究生，研究方向：畜產品加工和食品安全。

國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項經費項目（3-45）。