合歡皮提取物對黑曲霉抑菌活性的研究

白羨欽，代光輝，陳 佳，陳義娟，龐倩茹，郭 松（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物院，上海200240）

合歡皮提取物對黑曲霉抑菌活性的研究

白羨欽，代光輝*，陳 佳，陳義娟，龐倩茹，郭 松
（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物院，上海200240）

采用濾紙片法和生長速率法，測定了合歡皮乙醇提取物對4種常見菌種的抑菌活性；結果表明：合歡皮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度（MIC）為20mg/mL，對黑曲霉的抑制中濃度（EC50）為12.43mg/mL，即對黑曲霉抑菌效果較好。再進一步采用生長速率法，測定了合歡皮4種萃取物對黑曲霉（Aspergillus niger）的抑菌活性。4種萃取物中，正丁醇相對黑曲霉抑菌效果最好，其EC50為7.68mg/mL。結論：合歡皮乙醇提取物對黑曲霉的有效抑菌成分主要集中于正丁醇相，對于開發(fā)天然食品防腐劑有很大價值與潛力。

合歡皮，乙醇提取物，抑菌活性，黑曲霉

由微生物引起的食品腐敗問題十分嚴重，而且有的微生物是對人體有害的致病菌，有的則會產(chǎn)生對人體有害的毒素。例如，大腸桿菌易導致人體泌尿道感染和腹瀉；金黃色葡萄球菌不僅是導致人體化膿感染最常見的病菌[1]，還會分泌引起人類胃腸炎性等疾病的葡萄球菌腸毒素[2]；黑曲霉會產(chǎn)生損傷人體皮膚進而致癌的黃曲霉素、B1或單端孢菌毒素[3]，因此選用安全、有效的防腐劑是食品生產(chǎn)及貯藏的重要任務。

目前使用最廣泛的是化學合成防腐劑，主要有苯甲酸（鈉）、山梨酸（鉀）及亞硝酸鹽類等，但其仍存在著一定的安全隱患。而來源于植物、動物和微生物的天然防腐劑因其具有安全無毒等優(yōu)點，引起了人們的極大重視[4]。近年來，關于天然植物源防腐劑的研究逐漸增多，大多是從植物提取抑菌成分用于防腐。例如，顧仁勇等研究，由9%牛至精油、9%丁香精油、9%山蒼子精油及9%肉桂精油組成的復合保鮮劑可有效延長冷藏豬肉保鮮期[5]。何首林等研究，八角茴香油對富士蘋果有顯著的防腐作用；肉桂醛、丹參提取物等對番茄有顯著的防腐作用[6]。

合歡（Albizia julibrissin Durazz.）的干燥樹皮合歡皮是一種傳統(tǒng)中藥，其不僅化學成分復雜，還具有活血消腫、解郁安神、抗生育及增強免疫的醫(yī)療功效[7-8]。有多項研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮中含有的多種三萜皂苷對癌細胞的抑制作用較好[9-10]。但目前國內外針對合歡皮抑菌活性的報道較少，主要是針對合歡葉、合歡花或合歡莢果的抑菌活性的研究[11-15]。該研究主要測定了合歡皮提取物對4種菌的抑菌活性，并在此基礎上主要對黑曲霉的抑菌活性進行了研究，以期為開發(fā)新的天然植物源防腐劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

合歡皮 購于毫州市貢藥飲片廠，現(xiàn)存放于上海交通大學植物健康與天然產(chǎn)物實驗室，將購買后的合歡皮粉碎、冷藏備用；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.a）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.c）、白色念珠菌（Canidia albicans，C.a）、黑曲霉（Aspergillus niger，A.n） 由上海交通大學植物健康與天然產(chǎn)物實驗室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 蒸餾水1000mL、牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、瓊脂15g，pH7.0～7.2；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 蒸餾水1000mL、馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g；NaOH、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等 均為分析純；Phenonip 瑞士Clariant公司。

RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 上海比朗儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SA-960-Ⅱ型SHJ系列潔凈工作臺 上海匯龍儀表電子有限責任公司；SPX-100B-D型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DL-180超聲波 浙江省象山縣石浦海天電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 合歡皮乙醇提取物的制備 分別稱取1000g植物粉末，用10L 70%的乙醇密閉浸泡提取3次（5、2.5、2.5L），每次24h。每次浸泡后，抽濾1次，合并，得到合歡皮乙醇提取物。待圓底燒瓶晾至常溫、干燥，稱量，減去干凈空瓶在室溫、干燥時的重量，則是提取物的重量。3次抽濾得到的濾液，在45℃、-0.1MPa的條件下用旋轉蒸發(fā)器減壓濃縮至溶劑蒸干。加入一定體積的蒸餾水，超聲波振蕩溶解，配制成一定濃度的溶液，冷藏備用。

1.2.2 合歡皮溶劑萃取物的制備 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取合歡皮乙醇提取物的蒸餾水溶液5次，得到4種萃取物，分別在45℃、-0.1MPa的條件下用旋轉蒸發(fā)器減壓濃縮至溶劑蒸干，稱量，減去干凈空瓶在室溫、干燥時的重量，則是各萃取物的重量。加入一定體積的蒸餾水，超聲波振蕩溶解，配制成一定濃度的溶液。

1.2.3 菌懸液的制備 用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌。分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌接種于培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)20～22h活化，再將活化后的菌體轉入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩搖勻，分別稀釋成10-2～10-6CFU/mL的菌懸液。

1.2.4 抑菌活性的測定 采用濾紙片法[16]測定不同濃度的合歡皮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌活性。先將直徑為6mm的滅菌濾紙片在不同濃度的合歡皮乙醇提取物的蒸餾水溶液中浸泡2h。在培養(yǎng)基平板上分別均勻涂布金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的菌懸液各0.2mL。將浸泡后的濾紙片等距置于平板上，每個菌種設4個重復。設無菌水為陰性對照，質量分數(shù)為0.5%的Phenonip為陽性對照。37℃培養(yǎng)3d后，用十字交叉法測量并記錄抑菌圈直徑。

采用生長速率法[17-18]測定合歡皮乙醇提取物、各溶劑萃取物對黑曲霉的菌絲生長抑制率。含藥培養(yǎng)基的制備：將不同濃度的合歡皮提取液與培養(yǎng)基各按1∶4的比例混勻，倒入培養(yǎng)皿，配制成不同濃度的含藥培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻后將直徑為9mm的黑曲霉菌餅置于平板中央。設不含提取液的培養(yǎng)基為陰性對照，含質量分數(shù)為0.5%Phenonip的培養(yǎng)基為陽性對照。37℃培養(yǎng)3d后，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，根據(jù)以下公式計算菌絲生長抑制率。

式中：D1為對照組菌落直徑（mm）；D2為處理組菌落直徑（mm）。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用Duncan’s法對數(shù)據(jù)進行方差分析。并進行回歸分析，計算抑制中濃度（EC50）。

表1 合歡皮70%乙醇提取物對4種菌種的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of the 70%ethanolic extract of A.julibrissin Durazz.bark concents against four microoganisms

2 結果與分析

2.1 合歡皮乙醇提取物對4種菌的抑菌活性

由表1可知，在2.5～80mg/mL的濃度范圍內，合歡皮70%乙醇提取物對大腸桿菌、白色念珠菌無抑制作用，對金黃色葡萄球菌和黑曲霉則均有與濃度成正相關的抑菌效果，但對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較弱，其最低抑制濃度（MIC）為20mg/mL。而合歡皮70%乙醇提取物對黑曲霉的抑菌效果則比較明顯。在20～80mg/mL的濃度范圍內，合歡皮70%乙醇提取物對黑曲霉的抑菌率雖然低于陽性對照的抑菌率，但均達到52%以上。

表2 相同濃度合歡皮萃取物對黑曲霉的菌絲生長抑菌率（%）Table 2 Inhibition rates of four phases of A.julibrissin Durazz.bark extract with the same concentration against A.niger mycelial growth（%）

據(jù)金玉蘭等研究發(fā)現(xiàn)合歡葉乙醇提取物對蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）4種真菌均有一定抑菌活性[11]。賈福麗等也發(fā)現(xiàn)合歡莖葉乙醇提取物對棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、終極腐霉病菌（Pythium ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3種真菌也有一定抑制活性[14]。這些報道均說明合歡植物中存在一定的抗菌物質。而本實驗表明合歡皮乙醇提取物只對金黃色葡萄球菌和黑曲霉有抑制作用，對其他2種菌無效，說明合歡皮中的抗菌物質不是廣譜的，且對不同菌種的抑菌效果可能會有差異。

2.2 合歡皮乙醇提取物對黑曲霉菌絲生長抑制的EC50

通過擬合曲線，得到合歡皮70%乙醇提取物對黑曲霉菌絲生長抑制作用的毒力回歸方程為Y= 36.7630+5.2522Ln（X），相關系數(shù)為0.9862，由此求得合歡皮乙醇提取物對黑曲霉的EC50為12.43mg/mL。

2.3 合歡皮萃取物對黑曲霉菌絲生長的抑菌活性

由表2可知，當天數(shù)相同時，抑菌率最高的均是陽性對照，最低的均是陰性對照，且20mg/mL的四種萃取物按抑菌率由高到低依次排序：正丁醇相、乙酸乙酯相、石油醚相、水相，其中正丁醇相的抑菌率顯著高于石油醚相和乙酸乙酯相，只有水相無抑菌作用。在菌絲生長3～6d后，3種有效萃取物的抑菌率均隨時間增長而降低，但正丁醇相的抑菌率下降得比石油醚相和乙酸乙酯相慢。雖然20mg/mL正丁醇的抑菌率顯著低于陽性對照，但其仍可在菌絲生長6d后保持較高抑菌率，達74.84%，說明正丁醇相對黑曲霉菌絲生長的抑制效果具有持久性。由此結果可以看出合歡皮乙醇提取液中對黑曲霉的抑菌活性物質主要存在于正丁醇相中，屬于極性比較大的物質；而由石油醚相、乙酸乙酯相萃取出來的極性比較小的物質活性比較弱或者活性不持久。

金玉蘭等發(fā)現(xiàn)合歡葉乙醇提取物對蘋果腐爛病菌（V.mali）、番茄灰霉病菌（B.cinerea）、立枯絲核病菌（R.solani）和辣椒炭疽菌（C.capsici）4種真菌的抑菌活性物質主要存在于正丁醇相中[11]。賈福麗等也發(fā)現(xiàn)合歡莖葉乙醇提取物對棉花枯萎病菌（F. oxysporum f.sp.vasinfectum）、終極腐霉病菌（P. ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3種真菌的抑制活性物質也主要存在于正丁醇相中，而不是石油醚相、乙酸乙酯相或水相中[14]。由此可以推測，合歡植物乙醇提取物的正丁醇相中可能含有一定的抗真菌的活性物質，故對于合歡皮乙醇提取物正丁醇相的研究是有意義的。

2.4 合歡皮正丁醇相對黑曲霉菌絲生長的抑菌活性

表3 合歡皮正丁醇相對黑曲霉的菌絲生長抑菌率Table 3 Inhibition rates of the n-butanol phase of A.julibrissin Durazz.bark extract against A.niger mycelial growth

由表3可知，在0.3125～40mg/mL的濃度范圍內，合歡皮正丁醇相對黑曲霉有抑菌效果，且抑菌率均隨正丁醇相濃度增大而增大。40mg/mL正丁醇相對黑曲霉的菌絲生長抑菌率高達100.00%，與陽性對照相同，由此說明高濃度下的正丁醇相可以高效抑制黑曲霉的菌絲生長。0.3125、0.625、1.25mg/mL正丁醇相的抑菌率之間無顯著差異，當由1.25mg/mL增加到2.5mg/mL時，抑菌率顯著提高。2.5、5、10、20、40mg/mL正丁醇相的抑菌率之間兩兩差異顯著。

通過擬合曲線，得出合歡皮正丁醇相對黑曲霉菌絲生長抑制作用的毒力回歸方程為Y=12.3510+ 4.9039X，相關系數(shù)為0.9907，由此求得合歡皮正丁醇相對黑曲霉的EC50為7.68mg/mL。而金玉蘭等發(fā)現(xiàn)合歡葉正丁醇相對蘋果腐爛病菌（V.mali）、番茄灰霉病菌（B.cinerea）、立枯絲核病菌（R.solani）和辣椒炭疽菌（C.capsici）4種真菌的EC50在0.012～0.920mg/mL內[11]。賈福麗等也發(fā)現(xiàn)合歡莖葉正丁醇相對棉花枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.vasinfectum）、終極腐霉病菌（P.ultimum）和棉花立枯病菌（R.solani）3種真菌的EC50在0.8841～1.8958mg/mL內[14]?？梢钥闯龊蠚g葉或合歡莖葉對以上植物病原真菌的EC50均低于該實驗中合歡皮正丁醇相對黑曲霉的EC50，由此考慮到合歡莖葉對黑曲霉的抑菌效果是否也會高于合歡皮對黑曲霉的抑菌效果，還有待進一步研究的。

綜合以上結果，可以看出合歡皮提取物的正丁醇萃取相對黑曲霉的抑菌效果明顯，甚至與陽性對照效果相同，考慮到合歡皮中天然化學成分很多[8]，從該有效相中進一步分離和純化活性結構，對于進一步開發(fā)植物源天然防腐劑具有一定的意義，將在實驗室下一步工作中進行。

3 結論

通過測定合歡皮70%乙醇提取物對4種供試菌種的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)合歡皮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和黑曲霉均有抑菌作用，但對黑曲霉的抑菌效果較明顯。通過對黑曲霉抑菌效果的進一步研究發(fā)現(xiàn)合歡皮乙醇提取物的石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相中均含有對黑曲霉有抑菌作用的活性成分，而水相則對黑曲霉無效；其中正丁醇相對黑曲霉的抑菌效果更持久。且正丁醇相在高濃度時對黑曲霉抑菌作用很明顯：20mg/mL的濃度達到85.32%的抑菌率；40mg/mL的濃度則達到100.00%的抑菌率，與陽性對照Phenonip的抑菌效果相同。該研究結果為進一步開發(fā)植物源天然防腐劑奠定了一定的基礎。

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Study on the antimicrobial activity of Albizia julibrissin Durazz.bark extract against Aspergillus niger

BAI Xian-qin，DAI Guang-hui*，CHEN Jia，CHEN Yi-juan，PANG Qian-ru，GUO Song
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

The antimicrobial activities of the ethanolic extract of A.julibrissin Durazz.bark against four common microorganisms were evaluated using paper disc method and mycelial growth inhibition method.The results showed that the ethanolic extract had a minimal inhibitory concentration（MIC）of 20mg/mL against Staphylococcus aureus and a median effective concentration（EC50）of 12.43mg/mL against Aspergillus niger.These results indicated that the antimicrobial activity of the ethanolic extract against A.niger was higher than that against three other microorganisms.Then the four phases of the extract were tested against A.niger using mycelial growth inhibition method.The n-butanol phase was the most effective against A.niger among the four phases and its EC50was 7.68mg/mL.In conclusion，the bioactive constituents were mainly in the n-butanol phase and these results provided people with great value and potential in tapping natural food preservatives.

Albizia julibrissin Durazz.bark；ethanolic extract；antimicrobial activity；Aspergillus niger

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.019

2013－10－14 *通訊聯(lián)系人

白羨欽（1989-），女，碩士研究生，研究方向：植物源防腐劑。