棕櫚酰五肽-3裂解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

王小青，趙紅玲，高 楊，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

技術(shù)方法

棕櫚酰五肽-3裂解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

王小青，趙紅玲，高 楊，王良友，尹志峰

(河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

棕櫚酰五肽-3;裂解條件;單因素實(shí)驗(yàn)

棕櫚酰五肽-3(Matrixyl，氨基酸序列為Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser，縮寫(xiě)為PAL-KTTKS)是棕櫚酰寡肽系列抗皺多肽小分子的一種，其抗皺作用的機(jī)制為模擬信號(hào)肽KTTKS(來(lái)源于前膠原蛋白α1鏈的水解產(chǎn)物)，通過(guò)促進(jìn)Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白和纖維粘連蛋白的生成，增加皮膚厚度及減少細(xì)紋[1]。棕櫚酰五肽-3是近年來(lái)興起的一種化妝品原料，但高昂的價(jià)格限制了其廣泛應(yīng)用[1]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[2]，對(duì)棕櫚酰五肽-3的合成方法進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高棕櫚酰五肽-3的純度，為工業(yè)化量產(chǎn)提供參考[3-4]。

1 儀器與材料

戴安U3000高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器，美國(guó)戴安公司)，Newstyle型反相高效半制備液相色譜儀(蘇州漢邦科技有限公司)，戴安液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀Ultimate 3000/ MSQ(美國(guó)戴安公司)，CHRIST凍干機(jī)(北京博勵(lì)行儀器有限公司)，高速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，固相合成載體Wang樹(shù)脂(天津南開(kāi)合成科技有限公司，替代度為1.17mmol/g)，CTC樹(shù)脂(天津南開(kāi)合成科技有限公司，替代度為1.2mmol/g)肽鏈中所有保護(hù)氨基酸(成都誠(chéng)諾新技術(shù)有限公司)，HOBt與DIC(蘇州中科天馬肽工程中心有限公司)，冰乙醚與TFA(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，哌啶、苯甲硫醚、間甲酚與苯甲醚(上海晶純?cè)噭┯邢薰?，EDT(Sigma-Aldrich)，DMF(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 固相合成載體的選擇 采用Fmoc固相多肽合成策略，分別選擇Wang樹(shù)脂與CTC樹(shù)脂分別按照附圖所示的合成路線(xiàn)圖合成棕櫚酰五肽-3。

附圖 棕櫚酰五肽-3合成路線(xiàn)圖(以Wang樹(shù)脂為例)

2.2 肽樹(shù)脂裂解時(shí)間的選擇 按照表1合成步驟稱(chēng)量干燥至恒重的肽樹(shù)脂，進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，無(wú)水冰乙醚沉降，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復(fù)2次，真空干燥。

表1 采用不同裂解時(shí)間的實(shí)驗(yàn)方法

2.3 肽樹(shù)脂裂解前反應(yīng)方法的選擇 將干燥至恒重的肽樹(shù)脂置于玻璃燒瓶中，分別按照表2加入裂解液反應(yīng)。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，濾液用無(wú)水冰乙醚沉降，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復(fù)2次，真空干燥。

表2 采用不同裂解前反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法

2.4 肽樹(shù)脂裂解液倍量的選擇 將干燥至恒重的肽樹(shù)脂置于玻璃燒瓶中，按照表3加入裂解液反應(yīng)2h。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，濾液用無(wú)水冰乙醚沉降，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復(fù)2次，真空干燥。

表3 采用不同裂解液倍量實(shí)驗(yàn)方法

2.5 肽樹(shù)脂裂解體系的選擇 將干燥至恒重的肽樹(shù)脂置于玻璃燒瓶中，加入裂解液反應(yīng)2h。過(guò)濾，用少許TFA洗滌樹(shù)脂，濾液用無(wú)水冰乙醚沉降，析出白色固體，4000rpm離心4min，棄去上清液，重復(fù)2次，真空干燥。

表4 采用不同裂解液體系的實(shí)驗(yàn)方法

3 結(jié)果與討論

固相合成中固相載體的選擇非常關(guān)鍵，它不僅關(guān)系到合成速率，對(duì)合成目標(biāo)肽的純度、收率都有重要影響，CTC樹(shù)脂增量不明顯，且價(jià)格較貴，故而固相合成載體選擇Wang樹(shù)脂較好。

固相合成中為了得到純度更好的多肽，降低多肽純化得難度，需要對(duì)裂解條件進(jìn)行優(yōu)化，本研究對(duì)肽樹(shù)脂裂解反應(yīng)進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，裂解時(shí)間為2.5h，0℃反應(yīng)20min后逐步升高到30℃反應(yīng)2h，裂解液為12倍于肽樹(shù)脂，裂解體系選擇100% TFA體系裂解后粗肽純度最高。見(jiàn)表5。

表5 不同裂解條件對(duì)粗肽純度的影響結(jié)果

該結(jié)果作為多肽裂解的參考，但是在進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)時(shí)還應(yīng)考慮原料的價(jià)格以及中試結(jié)果對(duì)得率的影響。

[1]郭建維,鐘星,徐曉健.藥妝品勝肽的合成及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,30(3):1-8.

[2]王小青,趙紅玲,高楊,等.棕櫚酰五肽-3的固相合成[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,30(5):414-415.

[3]王德心.活性多肽與藥物開(kāi)發(fā)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2011.442-492.

[4]厲保秋.多肽藥物研究與開(kāi)發(fā)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.51-67.

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A

1004-6879(2014)05-0419-02

2014-03-12)