生大黃致結(jié)腸黑變病豚鼠腸動(dòng)力評(píng)估

羊燕群 吳之茵 馬志杭 陳建永 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科 杭州 310003

結(jié)腸黑變病為臨床高發(fā)病，如何在實(shí)驗(yàn)中建立與臨床病因、病機(jī)相符的動(dòng)物模型以協(xié)助臨床研究是消化科難題。我們通過(guò)既往豚鼠結(jié)腸黑變病實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[1]與臨床病因病機(jī)相結(jié)合，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，采用生大黃液豚鼠灌胃擬建立結(jié)腸黑變病動(dòng)物模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 5周齡普通級(jí)豚鼠36只，平均體質(zhì)量（236±32.73）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（浙）2008-0116。室溫 25℃，相對(duì)濕度50%～70%，每6只單籠飼養(yǎng)，造模前自由攝食、飲水。

1.2 藥 物 生大黃（浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑廠，批號(hào)121101，產(chǎn)地：甘肅），70℃熱水浸泡 30min，過(guò)濾成100%濃度生大黃液；聚乙二醇4000散（博福-益普生，批號(hào)C15563），配置成6.25%水溶液。

1.3 試 劑 二甲苯（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20120718）；無(wú)水乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20130130）；蘇木精（SIGMA，批號(hào) 041M0014V）；伊紅（上海邁坤化工有限公司，批號(hào)20120831）；鹽酸溶液（杭州雙林化工試劑廠，批號(hào)20120814）；中性樹(shù)膠（上海標(biāo)本模型廠）。

1.4 儀 器 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2135型，LEICA公司）；攤片機(jī)（HI1210型，LEICA公司）；烘片機(jī)（HI1220型，LEICA公司）；顯微鏡（BH2型，OLYMPUS公司）；冰箱（BCD-216型，青島海爾股份有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DRP-9082型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組 36只豚鼠用隨機(jī)數(shù)字表按完全隨機(jī)方法分為正常對(duì)照組、大黃組、福松組，每組各12只。正常對(duì)照組予自由進(jìn)食、進(jìn)水，不給藥；其余各組在自由進(jìn)食、進(jìn)水基礎(chǔ)上，大黃組每日給100%濃度大黃液4mL，對(duì)照組每日給滲透性瀉劑聚乙二醇4000散（商品名：福松）6.25%水溶液4mL。造模時(shí)間共42天。

2.2 觀察項(xiàng)目 實(shí)驗(yàn)第43天即造模結(jié)束次日，各組豚鼠禁食不禁水12h灌服100%硫酸鋇水溶液4mL，置于代謝籠中接取24h排出糞便，計(jì)算含鋇劑大便顆粒數(shù)。統(tǒng)計(jì)排便情況后各組豚鼠開(kāi)腹，每只豚鼠截取結(jié)腸上、中、下段結(jié)腸組織各1cm，置于中性甲醛固定，切片。通過(guò)HE染色檢測(cè)結(jié)腸組織病理學(xué)變化，驗(yàn)證模型成立。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況比較 造模結(jié)束，三組存活豚鼠正常組8只，大黃組10只，福松組7只。正常組豚鼠大便圓潤(rùn)、顆粒狀；大黃組豚鼠前3天大便稀爛量多，第4天開(kāi)始大便量減少，便質(zhì)變干；福松組豚鼠大便軟，含水量增加，顆粒較服藥前大及松散。三組豚鼠整體情況比較見(jiàn)表1。

表1 三組豚鼠一般情況比較

3.2 各組豚鼠24h排便顆粒數(shù)比較 大黃組平均大便顆粒數(shù)（34.2±8.9）粒，正常組平均（47.1±7.3）粒，福松組平均（42.7±4.3）粒，大黃組豚鼠排便顆粒數(shù)顯著少于正常組與福松組豚鼠排便量（P＜0.05）。

3.3 各組豚鼠結(jié)腸目測(cè)外觀改變 肉眼觀察25個(gè)結(jié)腸組織樣本中，正常組和福松組結(jié)腸黏膜形態(tài)、顏色正常，大黃組結(jié)腸黏膜顏色加深，并可見(jiàn)縱向褐色條索狀色素沉積帶，部分甚至呈黑色，從結(jié)腸近端向結(jié)腸遠(yuǎn)端逐漸變淺。見(jiàn)圖1（封二）。

3.4 各組腸黏膜病理改變 顯微鏡下正常組腸組織主要由黏膜層、黏膜下層和肌層構(gòu)成，黏膜上層完整，有少量炎性細(xì)胞，細(xì)胞類型主要為淋巴細(xì)胞和噬酸性細(xì)胞，黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。大黃組形態(tài)結(jié)構(gòu)類型及黏膜上皮炎細(xì)胞類型與正常組相同，黏膜固有層大量吞噬細(xì)胞中含有棕黑色顆粒狀物質(zhì)，黏膜下層脂肪組織明顯增多，肌層無(wú)明顯病變。福松組形態(tài)結(jié)構(gòu)類型及炎細(xì)胞類型與正常組相同，黏膜上皮無(wú)黃色顆粒狀物質(zhì)，黏膜上皮層杯狀細(xì)胞明顯增多，黏膜下層與肌層無(wú)明顯病變。見(jiàn)圖 2（封二）。

4 討 論

便秘是臨床常見(jiàn)病，蒽醌類瀉藥如大黃、蘆薈、番瀉葉、決明子等中藥由于其作用強(qiáng)、起效快，在臨床中藥湯劑及中成藥中均廣泛應(yīng)用。蒽醌類瀉藥主要成分為蒽醌類衍生物三羥甲基蒽醌，此類化合物主要作用于大腸，不受胃酸破壞，在小腸中被吸收入血，但對(duì)小腸無(wú)作用，在肝臟中水解為糖及蒽醌衍生物，再經(jīng)血液從大腸分泌入腸腔中，或直接由小腸轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸，在大腸中被水解，刺激大腸神經(jīng)叢而加強(qiáng)蠕動(dòng)，亦可抑制Na+-K+-ATP酶，減少大腸對(duì)水及Na+的回吸收，而起導(dǎo)瀉作用[2]。蒽醌類藥物隨著服用時(shí)間的延長(zhǎng)，其瀉下效果逐漸降低，為維持通便效果，患者往往逐漸加大劑量，產(chǎn)生依賴性，長(zhǎng)期濫用，便秘癥狀加重，患者甚至不能自行排便，部分長(zhǎng)期使用蒽醌類藥物患者可見(jiàn)結(jié)腸黑變病發(fā)生，并有研究認(rèn)為其與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生有一定相關(guān)性[3]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)期口服生大黃水溶液豚鼠目測(cè)結(jié)腸見(jiàn)典型的連續(xù)分布虎皮、網(wǎng)格狀花紋，鏡下HE染色可觀察到結(jié)腸黏膜固有層大量棕黑色顆粒沉積，確認(rèn)為黑變病結(jié)腸改變，而對(duì)照組豚鼠結(jié)腸未見(jiàn)該變化，含蒽醌苷的植物性瀉藥被認(rèn)為是導(dǎo)致大腸黑變病的主要藥物。

結(jié)腸動(dòng)力的研究方法有鋇條排出試驗(yàn)、球囊排出試驗(yàn)、閃爍掃描、化學(xué)染料標(biāo)記等[4]。本實(shí)驗(yàn)采用鋇劑標(biāo)記排出大便，操作簡(jiǎn)便，容易觀察，模型豚鼠有典型結(jié)腸黑變病改變，并初步證明黑變病豚鼠結(jié)腸排便功能下降，結(jié)腸動(dòng)力障礙。

圖1 大黃組豚鼠結(jié)腸黏膜表面大黃組結(jié)腸黏膜顏色加深，并可見(jiàn)縱向褐色條索狀色素沉積帶，部分甚至呈黑色，從結(jié)腸近端向結(jié)腸遠(yuǎn)端逐漸變淺。

圖2 三組豚鼠結(jié)腸HE染色正常組：黏膜上層完整，有少量炎性細(xì)胞，細(xì)胞類型主要為淋巴細(xì)胞和噬酸性細(xì)胞，黏膜下層和肌層結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。大黃組：形態(tài)結(jié)構(gòu)類型及黏膜上皮炎細(xì)胞類型與正常組相同，黏膜固有層大量吞噬細(xì)胞中含有棕黑色顆粒狀物質(zhì)，黏膜下層脂肪組織明顯增多，肌層無(wú)明顯病變。福松組：形態(tài)結(jié)構(gòu)類型及炎細(xì)胞類型與正常組相同，黏膜上皮無(wú)黃色顆粒狀物質(zhì)，黏膜上皮層杯狀細(xì)胞明顯增多，黏膜下層與肌層無(wú)明顯病變。

［1］陳建永，潘鋒，張濤.結(jié)腸黑變病模型復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（3）：514-516.

［2］Kim BJ，Lee JH，Jun JY，et al.Vasoactive intestinal polypeptide inhibits pacemaker activity via the nitric oxide-cGMP-protein kinase G pathway in the interstitial cells of Cajal of themurine small intestine［J］.Molecules and Cells，2006，21（3）：337-342.

［3］陳建永，潘鋒，張濤.大黃致結(jié)腸黑變病豚鼠腫瘤壞死因子-a水平變化及意義［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（2）：140-142.

［4］楊海濤，蔡中其節(jié)譯，周殿元校.結(jié)腸動(dòng)力的研究［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)（消化系疾病分冊(cè)），1993，13（2）：78-81.