巨峰葡萄低溫貯藏過程中主要多糖降解酶活性變化的研究

朱丹實(shí)，梁潔玉，曹雪慧，馮敘橋，勵(lì)建榮，*，孟憲軍

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

巨峰葡萄低溫貯藏過程中主要多糖降解酶活性變化的研究

朱丹實(shí)1，2，梁潔玉1，曹雪慧1，馮敘橋1，2，勵(lì)建榮1，*，孟憲軍2，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

果蔬細(xì)胞壁酶活性與果實(shí)的種類和貯藏品質(zhì)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以巨峰葡萄為原料，研究不同冷藏溫度（0℃和4℃）下與葡萄漿果軟化相關(guān)的多種酶類：果膠酯酶（PE）、葡聚糖內(nèi)切酶（EGase）、果膠內(nèi)切酶（endo-PG）和果膠外切酶（exo-PG）活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，冰溫可以較好地抑制細(xì)胞壁酶活性，延長貯藏期。較低的貯藏溫度對(duì)PE的影響不大，0℃貯藏延緩了EGase活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間，有效的降低了endo-PG和exo-PG活性。總體來看，EGase、endo-PG和exo-PG活性的變化對(duì)葡萄貯藏過程中質(zhì)地變化及腐爛起到了更為重要的作用。

葡萄，低溫貯藏，軟化，細(xì)胞壁，酶活

漿果軟化是鮮食葡萄品質(zhì)劣變的主要因素之一，果實(shí)軟化主要是由于構(gòu)成細(xì)胞壁物質(zhì)的多糖大分子的降解引起的[1]。葡萄的貯藏過程中多種細(xì)胞壁酶類都參與了果實(shí)的軟化過程，而葡萄漿果軟化初期主要是果膠類大分子的降解[2]，因此果膠酶在葡萄漿果軟化過程中的作用比較突出。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，簡(jiǎn)稱PG）是果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵酶之一，主要功能是將果實(shí)細(xì)胞壁多糖中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸[3]，使細(xì)胞壁中膠層解體[4]，導(dǎo)致果實(shí)軟化。大多數(shù)果實(shí)存在果膠外切酶（exo-PG）和果膠內(nèi)切酶（endo-PG）[5-6]。葡聚糖內(nèi)切酶（endo-β-1，4-D-glucanase或EGase）可以水解鄰接非取代殘基的葡聚糖鏈上的1，4-β-D-糖苷鍵。EGase的底物可能包括木葡聚糖、非晶體纖維素表面部位，也可能包括葡聚甘露糖，其上由連續(xù)的1，4-β-D-糖苷鍵連接成的葡聚糖有利于底物與酶的結(jié)合[7-8]。果膠酯酶（pectin esterase，簡(jiǎn)稱PE）[9-10]廣泛存在于高等植物中，果膠甲酯酶（PME）作用是水解果膠分子中甲酯化的C6羧基[11]，使之生成多聚半乳糖醛酸和甲醇，因此PME的活動(dòng)似乎是PG活動(dòng)的必要前提。

目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)鮮食葡萄多糖降解相關(guān)酶活的系統(tǒng)研究很少，而研究葡萄中各種多糖酶類的作用，并采取適當(dāng)?shù)拇胧┮种萍?xì)胞壁酶活性延長漿果的貯藏期是非常重要的。本研究以巨峰葡萄為原料，主要考察葡萄在成熟過程中不同冷藏溫度對(duì)葡萄中PE、EGase、endo-PG和exo-PG活性的影響，為采取有效的酶活性抑制方法，降低漿果軟化，延長葡萄貯藏期提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮巨峰葡萄（Vitis vinifera×V.labrusca） 于2012年8月下旬采自錦州果樹農(nóng)場(chǎng)，采收后立即運(yùn)回渤海大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，挑選果實(shí)大小均一，成熟度基本一致，無病蟲害、無機(jī)械損傷的葡萄果穗作為實(shí)驗(yàn)原料，分為0℃和4℃兩組貯藏，葡萄冷藏期間，每7天測(cè)定1次各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)3次；聚乙二醇、亞硫酸氫鈉、醋酸鈉、氯化鈉、醋酸、硼酸、硼酸鹽、氰基乙酰胺、EDTA、氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸鹽、CMC等 均為國產(chǎn)分析純；D-（+）半乳糖醛酸，BR（沃凱）；多聚半乳糖醛酸 分子量25000～50000，美國Alfa Aesar公司。

Sorall biofuge stators冷凍高速離心機(jī) Thermo Scientific有限公司；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器 金壇市瑞華儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器有限公司；PL303電子天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-98-IIH電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；烏氏粘度計(jì) 上海森地科學(xué)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的提取 參考Zhou等[12]測(cè)定酶活性的方法，略有改進(jìn)。取60g冷凍的葡萄果肉組織，加入60mL冷的12%的聚乙二醇和0.2%的亞硫酸氫鈉溶液在冰浴中研磨成勻漿。勻漿在13000×g條件下離心10min，用4℃的0.2%的硫酸氫鈉水溶液洗滌沉淀。將沉淀平均分成3份，分別提取PE、（endo-PG和exo-PG）、EGase。對(duì)于endo-PG和exo-PG，將沉淀在22.5mL冷的含有0.5mol/L的NaCl的50mmol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH5）在4℃下振蕩1h。將上清液用50mmol/L的醋酸鈉緩沖液按1∶1和1∶20的比例稀釋，分別作為測(cè)定endo-PG和exo-PG活性的粗提液。

1.2.2 PE活性測(cè)定 將濾渣再懸浮到22.5mL 7.5%（w/v）NaCl溶液中，用0.75%的EDTA調(diào)節(jié)pH為6.5，在4℃下放置10min。13000×g、10min離心后收集上清液。取5mL酶的粗提液，加入到20mL l%（w/v）果膠液中，在30℃下用0.01mol/L NaOH滴定，保持pH在7.4，測(cè)定10min，以NaOH的消耗量來確定酶活性。酶活力單位（mL·g-1·10min-1）：以每10min單位鮮果實(shí)消耗0.01mol/L NaOH的量表示酶活性。

1.2.3 EGase活性測(cè)定 采用粘度法，利用烏氏粘度計(jì)測(cè)定。將濾渣置于22.5mL用0.1mol/L的檸檬酸磷酸鹽緩沖液配成的含有1mol/L NaCl、pH為6.0的溶液中，在4℃下振蕩1h，然后13000×g、10min離心，將上清液作為粗提取液。取5mL上清液與10mL含0.2%（w/v）的CMC檸檬酸磷酸鹽緩沖液反應(yīng)。酶活力單位（s·g-1·h-1）：以每小時(shí)每單位鮮果實(shí)酶提取液反應(yīng)的粘度變化量表示酶活性。

1.2.4 Exo-PG活性測(cè)定 取0.75mL酶提取液，加入到等體積的用50mmol/L的醋酸鈉（pH5.5）緩沖液配成的0.5%的多聚半乳糖醛酸溶液（pH4.4）即取反應(yīng)溶液1.5mL，30℃放置18h。加入10mL硼酸鹽緩沖劑（0.1mol/L，pH9.0）和1.5mL 1%氰基乙酰胺，煮沸10min，冷卻，在274nm下測(cè)吸光值，重復(fù)3次。用半乳糖醛酸溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位（μg·g-1·h-1）：以每小時(shí)單位鮮果實(shí)重產(chǎn)生的半乳糖醛酸的量表示酶活性。

1.2.5 Endo-PG活性測(cè)定 采用粘度法，利用烏氏粘度計(jì)測(cè)定。將6mL的酶提取液和9mL用50mmol/L的醋酸鈉緩沖液配成的2%的多聚半乳糖醛酸，30℃放置18h。酶活力單位（s·g-1·h-1）：以每小時(shí)單位鮮果實(shí)酶提取液反應(yīng)粘度的變化量表示酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差和顯著性分析，利用Origin Pro 8作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下葡萄果膠酯酶活性變化

在0℃和4℃貯藏時(shí)，巨峰葡萄的PE變化如圖1所示。由圖1可以看出，葡萄由室溫下分別放入0℃和4℃冷庫以后，PE活性在貯藏初期隨著貯藏時(shí)間的延長急劇下降，20～30d后逐漸回升，此時(shí)葡萄的質(zhì)地變化較采摘后已有變化較大，組織明顯變軟。在50d左右，PE的活性達(dá)到較高的峰值，此時(shí)4℃貯藏的葡萄幾乎全部腐敗，發(fā)霉現(xiàn)象比較嚴(yán)重。0℃貯藏的葡萄PE活性在貯藏65d后略有上升，貯藏至70d時(shí)葡萄幾乎全部腐爛。從圖1中可以看出，0℃和4℃貯藏葡萄的PE活性變化趨勢(shì)基本一致，而且差異大多不顯著（p＞0.05）。這說明雖然感官上0℃和4℃貯藏葡萄質(zhì)地變化的差異和腐爛的快慢程度不同，但較低的溫度條件對(duì)與PE變化的影響并不大。這可能是由于PE活性只受一定溫度范圍的影響，在4℃以下低溫條件下，PE酶的活性幾乎不受到溫度的影響。PE在葡萄貯藏初期下降明顯，可能是由于中PE具有啟動(dòng)PG活性的作用[13]，在果膠物質(zhì)降解和果實(shí)軟化中起輔助作用。

圖1 冷藏溫度對(duì)葡萄果膠酯酶活性的變化的影響Fig.1 The effect of different cold temperature on the activity of PE in grape during storage

2.2 葡萄在不同溫度下葡聚糖內(nèi)切酶活性變化

0℃和4℃貯藏時(shí)巨峰葡萄的EGase變化如圖2所示。從圖2可以看出，葡萄由室溫分別放入0℃和4℃冷庫中，開始幾天EGase活性變化不大，隨著貯藏時(shí)間的延長，兩種貯藏溫度下的EGase的活性都呈現(xiàn)兩次先升高后降低的趨勢(shì)。EGase由于基因表達(dá)的復(fù)雜性[14]，在葡萄細(xì)胞中天然底物尚不明確。在細(xì)胞壁中，EGase的底物可能包括木葡聚糖、非晶體纖維素表面部位，也可能包括葡聚甘露糖，其上由連續(xù)的1，4-β-D-糖苷鍵連接成的葡聚糖有利于底物與酶的結(jié)合[8]，然而確切的EGase作用機(jī)理仍不清楚。從圖2中可以看出，由于受溫度影響，4℃貯藏EGase活性兩次峰值出現(xiàn)時(shí)間均比0℃葡萄貯藏提前兩周，導(dǎo)致4℃葡萄腐爛提前，貯藏期相對(duì)較短，說明EGase與葡萄質(zhì)地變化腐爛過程密切相關(guān)。因此，推斷在葡萄貯藏過程中采用合適的方法推遲EGase活性升高，可以延長葡萄的貯藏期。

圖2 冷藏溫度對(duì)葡萄葡聚糖內(nèi)切酶活性的變化的影響Fig.2 The effect of different temperature on the activity of EGase in grape during cold storage

2.3 葡萄在不同溫度下內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶活性變化

Endo-PG主要在果膠分子內(nèi)部隨機(jī)切開α-1，4半乳糖苷鍵[15]，從而生成寡聚糖及半乳糖醛酸[15]。內(nèi)切型多聚半乳糖醛酸酶可使果膠及果膠酸巨峰葡萄endo-PG活性在0℃和4℃時(shí)的變化見圖3。從圖3可以看出，在4℃貯藏的葡萄，endo-PG活性在貯藏初期出現(xiàn)了一個(gè)比較明顯的峰值，之后逐漸降低，而0℃貯藏的葡萄基本屬于持續(xù)波動(dòng)下降的趨勢(shì)。由此可見，endo-PG在貯藏初期受溫度的影響較大。貯藏28d之前0℃和4℃的葡萄endo-PG活性有顯著性差異（p＜0.05），貯藏28d后，兩個(gè)溫度的貯藏條件對(duì)endo-PG活性的影響明顯減小，除了42d時(shí)有顯著性差異（p＜0.05）外，其他時(shí)間該酶的活性均無顯著性差別?？傮w來看，0℃貯藏更有利于降低endo-PG活性，也更有利于減少果膠類多糖的降解。同時(shí)也說明了endo-PG是影響葡萄貯藏期的重要酶類。

圖3 冷藏溫度對(duì)葡萄果膠內(nèi)切酶活性的變化的影響Fig.3 The effect of different temperature on the activity of endo-PG in grape during cold storage

2.4 葡萄在不同溫度下外切多聚半乳糖醛酸酶活性變化

exo-PG是半乳糖醛酸的端切酶[15]，不僅使粘度下降，還使其還原力明顯增強(qiáng)[16]。巨峰葡萄exo-PG活性在0℃和4℃時(shí)的變化見圖4。由圖4可知，在0℃和4℃貯藏時(shí)，葡萄exo-PG活性都基本呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。溫度較低時(shí)，exo-PG的酶活也較低，說明葡萄exo-PG活性對(duì)溫度條件的明顯比較敏感。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，溫度對(duì)葡萄exo-PG活性的影響都比較大。葡萄在0℃的貯藏期顯著高于4℃（p＜0.05），說明exo-PG對(duì)葡糖貯藏過程中質(zhì)地變化及腐爛起到了較為重要的作用。

圖4 冷藏溫度對(duì)葡萄果膠外切酶活性的變化的影響Fig.4 The effect of different temperature on the activity of exo-PG in grape during cold storage

3 結(jié)論

在低溫冷庫貯藏，0℃貯藏巨峰葡萄可以達(dá)到最高70d的貯藏期，而在相同條件下，4℃貯藏55d葡萄已基本霉腐變質(zhì)而失去食用價(jià)值，這說明冰溫更有利于巨峰葡萄貯藏。由0℃及4℃葡萄貯藏過程中各細(xì)胞壁酶活性變化測(cè)定結(jié)果表明：冰溫可以更有效地抑制endo-PG和exo-PG酶活性的增加，延緩EGase峰值的出現(xiàn)，但是對(duì)PE的影響與4℃貯藏的差異性不大。通過溫度條件對(duì)貯藏期影響及各種酶活性變化的結(jié)果綜合來看，EGase、endo-PG和exo-PG活性的變化對(duì)葡糖貯藏過程中質(zhì)地變化及腐爛起到了更為重要的作用。因此，采取適當(dāng)措施抑制EGase、endo-PG和exo-PG活性的變化，對(duì)貯藏期內(nèi)有效降低細(xì)胞壁多糖的降解，維持葡萄較佳的質(zhì)構(gòu)特性，延長葡萄貯藏期起到積極的作用。

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Study on enzymes of polysaccharide degradation during cold storage of Kyoho grape

ZHU Dan-shi1，2，LIANG Jie-yu1，CAO Xue-hui1，F(xiàn)ENG Xu-qiao1，2，LI Jian-rong1，*，MENG Xian-jun2，*
（1.Research Institute of Food Science，Bohai University.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University.Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China；2.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Cell wall enzymatic activity was closely related to the type and storage quality of fruit.In this study，Kyoho grape was used as the raw material.Changing regulation of several cell wall enzymatic activity of grape berry，such as PE，EGase，endo-PG and exo-PG which was bound up with berry softening at different cold storage temperature（0℃and 4℃）were studied.The result showed that，ice temperature could be effective to inhibit the activity of cell wall enzymes to prolong the storage time.What’s more，the lower temperature had little effects on the changing of PE activity，and preservation at 0℃ could prolong the time of max value of EGase activity and reduce the activity of endo-PG and exo-PG.Overall，the changing of EGase，endo-PG and exo-PG activity in grape had a grater influence on the quality and deterioration of grape during storage.

grape；cold storage；softening；cell wall；enzymatic activity

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0331-04

2013－07－19 *通訊聯(lián)系人

朱丹實(shí)（1978-），女，博士研究生，講師，研究方向：農(nóng)水產(chǎn)品貯藏加工。

遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（LNSAKF2011026）；遼寧省食品質(zhì)量與安全優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SPCX12）。