異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻chlorella sp.生產(chǎn)葉黃素條件的優(yōu)化

王淑慧，林河通，汪 靚，曹莉莉

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210；3.上海投資咨詢公司，上海200003）

異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻chlorella sp.生產(chǎn)葉黃素條件的優(yōu)化

王淑慧1，2，林河通1，汪 靚2，*，曹莉莉3

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210；3.上海投資咨詢公司，上海200003）

研究了異養(yǎng)條件下不同碳源、氮源、pH和溫度等因素對一株自分離小球藻的生長及葉黃素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，葡萄糖和硝酸鉀分別是支持這株小球藻持續(xù)快速生長生產(chǎn)葉黃素的最佳碳源和氮源。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)葉黃素的最佳條件為：葡萄糖濃度20g·L-1、硝酸鉀濃度1.25g·L-1，初始pH6.0，溫度30℃，葉黃素產(chǎn)量為12.27mg·L-1。

異養(yǎng)培養(yǎng)，小球藻，葉黃素，碳源，氮源

小球藻（Chlorella）為單細胞藻類，在分類學(xué)上屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、綠球藻目（Chlorococcale）、小球藻科（Chlorellaceae）的一屬[1]。小球藻細胞中含有葉綠體等光合作用器官，可以利用光能和二氧化碳進行自養(yǎng)生長，某些藻種可在無光條件下，利用有機碳源進行異養(yǎng)生長[2-3]。小球藻富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、葉黃素和多種維生素[4]，營養(yǎng)豐富、全面、均衡，具有極高的營養(yǎng)價值和生理功效。其中葉黃素具有廣泛的生物學(xué)活性[5]：它能有效地清除自由基、刺激肌體的免疫反應(yīng)、增強細胞間隙聯(lián)絡(luò)通訊、抑制腫瘤細胞的生長等，具有保護視力、防止老年人視黃斑退化、抗氧化、延緩動脈硬化、抗癌、抗衰老，預(yù)防潰瘍等許多藥用保健功效，是目前國際上食品功能性成分研究中的一個熱點。

葉黃素（lutein）廣泛存在于花卉、水果、蔬菜等植物中，其中萬壽菊為目前最主要的葉黃素來源[6-8]。然而大規(guī)模的栽培，存在占地面積大、易受季節(jié)、氣候及地域等條件的限制，造成生產(chǎn)效率低、提取成本高昂[9]。采用化學(xué)方法合成工藝復(fù)雜、難以合成單一異構(gòu)體的葉黃素，而且其生理活性明顯低于天然提取的產(chǎn)物[10]。研究發(fā)現(xiàn)微藻類不僅生長速度快，且細胞中的類胡蘿卜素特別是葉黃素含量可達0.27%～0.31%[4，11-13]，因此人們對微藻作為葉黃素的另一來源進行了一系列的研究[4]。

目前發(fā)現(xiàn)富含葉黃素的微藻主要包括小球藻（Chlorella）、Muriellopsis sp.和柵藻（Scenedesmus）等，基本上均屬綠藻門（Chlorophyta）[5]。Shi[14]比較了來源于3種類型小球藻（C.vulgaris、C.protothecoides、C.pyrenoidosa）藻株在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下的細胞生長和葉黃素合成能力，發(fā)現(xiàn)其中C.protothecoides CS-41的葉黃素含量最高，在30L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下，細胞葉黃素含量及產(chǎn)量分別為4.85mg·g-1和66.3mg·L-1。Sansawa等[15]對小球藻C.regularis S-50進行異養(yǎng)培養(yǎng)，細胞干重和葉黃素產(chǎn)量分別達到84g·L-1和3.5mg·g-1。Sanchez等[16]從自然界中分離得到一株高產(chǎn)葉黃素的柵藻（S.almeriensis），細胞中葉黃素含量達到5.5mg·g-1。從細胞生長和細胞葉黃素產(chǎn)量上綜合考慮，小球藻是目前最具生產(chǎn)潛力的藻類葉黃素源。本研究通過單因素影響實驗探討了不同培養(yǎng)條件下小球藻細胞生長和葉黃素含量變化，旨在為異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)葉黃素等天然功能性成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻（Chlorella sp.） 用TAP培養(yǎng)基制成瓊脂平板保存藻種，用基礎(chǔ)Basal培養(yǎng)基異養(yǎng)轉(zhuǎn)化、二級放大用于實驗研究；葡萄糖、碳酸氫鈉、硝酸鉀、氯化銨、尿素、二氯甲烷 均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈 HPLC色譜純，Sigma-Aldrich公司；葉黃素標準品 Sigma-Aldrich公司。

RID-10A/SPD-20A高效液相色譜儀 日本SHIMADZU；BSA 224S-CW電子天平、PB-10 pH計

德國Sartorius；ZHJH-C1115C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；HZ-9310KBG光照冷凍搖床 太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器 日本三洋；ZHWY-110X50往返式恒溫水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；Centrifuge5424小型離心機 德國Eppendorf；HACH DR2800分光光度計 美國哈希。

1.2 培養(yǎng)條件

用于小球藻擴培的為基礎(chǔ)Basal培養(yǎng)基[17]。培養(yǎng)器皿為250mL三角瓶，培養(yǎng)量100mL，pH調(diào)至6.5，經(jīng)過115℃15min的高溫滅菌后在28℃搖床中暗培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200r/min。

1.2.1 碳源的確定 分別以葡萄糖、乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源，設(shè)定初始的總碳濃度為4g·L-1。硝酸鉀為氮源，保持其濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.2.2 葡萄糖濃度的確定 初始葡萄糖濃度分別為：0、5、10、20、30、40、60、120g·L-1。硝酸鉀為氮源，保持其濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.2.3 氮源的確定 分別以硝酸鉀、氯化銨、尿素作為唯一氮源，初始的總氮濃度為173mg·L-1。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.2.4 硝酸鉀濃度的確定 初始硝酸鉀濃度分別為：0、0.625、1.25、2.5、5、10g·L-1。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1，保持pH為6.5，在28℃200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.2.5 pH的確定 初始pH分別為：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1；硝酸鉀為氮源，濃度為1.25g·L-1，在28℃200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.2.6 溫度的確定 培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為：20、25、28、30、34、37℃。葡萄糖為碳源，其濃度為10g·L-1；硝酸鉀為氮源，濃度為1.25g·L-1，保持pH為6.5，200r/min搖床暗培養(yǎng)。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定 采用濁度比色法[18]。濁度比色法用HACH DR 2800分光光度計測定培養(yǎng)液在540nm處的光密度（OD540），測定時確保OD在0.2～0.8之間。

1.3.2 葡萄糖的測定 利用3，5-二硝基水楊酸法，具體參照參考文獻[19]。

1.3.3 硝酸根的測定 采用水質(zhì)-硝酸鹽氮的測定-紫外分光光度法。

1.3.4 葉黃素的提取 采用桂林等[20]有機溶劑萃取法。在小球藻培養(yǎng)過程中及結(jié)束后，取2mL藻液，離心（10000r/min，10min），棄上清，將沉降于離心管底部的藻泥進行-20℃冷凍48h，加入2mL甲醇/二氯甲烷（體積比2∶1）溶液，水浴搖床（35℃，150r/min）30min，離心（10000r/min，2min），取上清液進行HPLC測定。

1.3.5 葉黃素的檢測 葉黃素標準品用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、40、50mg·L-1的葉黃素標準溶液，在HPLC上進行測定，得到葉黃素峰面積（y）與葉黃素濃度（x）的一元線性回歸方程（y=173534x-373008，R2=0.9991）。實驗中根據(jù)測定樣品的峰面積帶入建立的一元線性回歸方程，即可計算出對應(yīng)的葉黃素濃度。

色譜條件為：高效液相色譜（HPLC）儀（島津LC-20AD泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器）、Agilent Zorbax Ecipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱、流動相為甲醇/乙腈（v/v）∶90/10，流速為1mL/min，進樣量為20μL，柱溫28℃，檢測波長447nm。

圖1 不同碳源條件下OD的變化Fig.1 The variation of OD under different carbon source

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

圖1顯示葡萄糖作為碳源時，小球藻可持續(xù)快速生長，且在第3d生物量達最大（OD540為17.58）；乙酸鈉為碳源時，初期生長狀況良好，培養(yǎng)至第2d生物量最大（OD540為6.7），之后出現(xiàn)生長抑制。由圖2可以看出，隨著CH3COO-的利用，培養(yǎng)基的pH逐漸升高，達抑制小球藻生長的9.0以上，這與文獻[21]得到的結(jié)果一致；甲醇為碳源時，小球藻生長停滯，可見小球藻不能利用甲醇做碳源進行異養(yǎng)生長。上述結(jié)果表明，葡萄糖是支持小球藻快速穩(wěn)定生長的最佳碳源。這與文獻[21-23]得到的結(jié)果一致。

圖2 不同碳源條件下pH的變化Fig.2 The variation of pH under different carbon source

由圖3可以看出，以葡萄糖、乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源時，小球藻均可生產(chǎn)葉黃素。當以葡萄糖為唯一碳源時，葉黃素產(chǎn)量最高達9.339mg·L-1；以乙酸鈉、甲醇作為唯一碳源時，葉黃素的含量僅為葡萄糖作碳源時的76.9%和52%，進一步說明葡萄糖不僅支持小球藻快速生長，而且有利于小球藻細胞葉黃素的積累。

圖3 碳源對葉黃素的產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the lutein yield

2.2 葡萄糖濃度對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

確定葡萄糖為最佳碳源之后，進一步探索其最佳添加濃度。培養(yǎng)基中葡萄糖的初始濃度分別設(shè)置為：0、5、10、20、30、40、60、120g·L-1。由圖4可以看出，異養(yǎng)條件下不添加葡萄糖，小球藻不增殖；當葡萄糖濃度較低（＜20g·L-1）時，培養(yǎng)后期出現(xiàn)生長停滯，這是由于葡萄糖消耗殆盡，培養(yǎng)基中缺乏碳源所致，說明葡萄糖是小球藻異養(yǎng)生長的限制性基質(zhì)；高濃度的葡萄糖（＞20g·L-1）則抑制小球藻生長，并且抑制現(xiàn)象隨著糖濃度增加越來越明顯。故適宜小球藻異養(yǎng)生長的最佳葡萄糖濃度為20g·L-1。

由圖5可以看出，當葡萄糖濃度≤60g·L-1時，葉黃素的產(chǎn)量隨葡萄糖濃度的升高而增大，其中當葡萄糖濃度為0～20g·L-1時，隨葡萄糖濃度的增大，葉黃素產(chǎn)量增長速度明顯；葡萄糖初始濃度為20～60g·L-1培養(yǎng)4d后，葉黃素產(chǎn)量逐漸增大，但增長幅度較??；當葡萄糖濃度達到120g·L-1時，小球藻生物量與空白相比幾乎無增長，導(dǎo)致葉黃素產(chǎn)量較低，只有3.35mg·L-1。培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中的殘?zhí)?。當葡萄糖初始濃度?0、20、30、40、60g·L-1時，其剩余濃度分別為0、7.56、17.89、27.94、50.6g·L-1。綜合考慮葡萄糖利用及最終葉黃素濃度，葡萄糖的最佳濃度選擇20g·L-1。

圖5 葡萄糖濃度對葉黃素產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of glucose concentration on the lutein yield

2.3 不同氮源對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

圖6、圖7結(jié)果顯示，在硝酸鉀、氯化銨、尿素三種氮源下，小球藻均能生長，但因種類不同，生長狀況各異。硝酸鉀作為唯一氮源時，小球藻持續(xù)快速生長，且培養(yǎng)3d后生物量達最大（OD540為17.55），尿素作為唯一氮源時，初期生長狀況良好，培養(yǎng)至第3d生物量達到較高水平，OD540為15.3，可見小球藻可以利用尿素作為氮源進行生長；氯化銨作為唯一氮源時，培養(yǎng)第1d小球藻生長良好，此后進入生長停滯階段，這是由于隨著NH4+被小球藻吸收利用，為保證細胞內(nèi)電荷平衡釋放出對應(yīng)數(shù)量的H+，使得培養(yǎng)基中的pH迅速降低至4.5以下，抑制了小球藻的進一步生長[22]。上述結(jié)果表明，與氯化銨、尿素相比，硝酸鉀是支持小球藻快速穩(wěn)定生長的最佳氮源。

由圖8可以看出，以硝酸鉀、氯化銨、尿素作為唯一氮源時，小球藻均可產(chǎn)生葉黃素。當以硝酸鉀為唯一氮源時，葉黃素產(chǎn)量最高達9.338mg·L-1（干重計的產(chǎn)量為：2.159mg·g-1）；以尿素作為唯一氮源時，葉黃素的含量次之為7.263mg·L-1，以氯化銨為唯一氮源時，葉黃素的產(chǎn)量最低，僅為5.071mg·L-1，進一步說明硝酸鉀不僅支持小球藻快速生長，而且有利于小球藻細胞中葉黃素的合成。對比王素琴等[21]以硝酸鉀為氮源，利用USTB01生產(chǎn)葉黃素，其產(chǎn)量為0.69mg·g-1。

圖6 氮源對小球藻生長的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on growth of Chlorella vulgar

圖7 不同氮源條件下pH的變化Fig.7 The variation of pH under different carbon resource

圖8 氮源對葉黃素的產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of nitrogen source on the lutein yield

2.4 氮源濃度對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

確定硝酸鉀為最佳氮源之后，進一步探索其最佳添加濃度。設(shè)定培養(yǎng)基中硝酸鉀的初始濃度為：0、0.625、1.25、2.5、5、10g·L-1。由圖9可以看出，異養(yǎng)條件下不添加硝酸鉀，小球藻有微弱的生長跡象，生長極其緩慢；當硝酸鉀的濃度≤1.25g·L-1時，OD540隨硝酸鉀濃度的增大而增大；當硝酸鉀的濃度為1.25～10g·L-1之間時，隨著硝酸鉀濃度的增大，小球藻的生長略受抑制。說明適宜小球藻異養(yǎng)生長的最佳硝酸鉀濃度為1.25g·L-1。

圖9 硝酸鉀濃度對小球藻異養(yǎng)生長的影響Fig.9 The effect of potassium nitrate concentration on growth of Chlorella sp.

由圖10可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，葉黃素的產(chǎn)量隨硝酸鉀濃度的升高而增大，說明硝酸鉀是影響葉黃素產(chǎn)量的限制性因子。其中當硝酸鉀濃度為0～1.25g·L-1時，隨硝酸鉀濃度的增大，葉黃素產(chǎn)量增大速度較快，這與此濃度區(qū)間微藻生物量的線性增長密切相關(guān)；硝酸鉀初始濃度為2.5g·L-1，培養(yǎng)4d后，葉黃素產(chǎn)量為10.46mg·L-1；當硝酸鉀濃度為10g·L-1時培養(yǎng)4d后，葉黃素產(chǎn)量達12.3mg·L-1。培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中的殘氮（NO3--N），結(jié)果如下：當硝酸鉀初始濃度小于1.25g·L-1時，培養(yǎng)4d后，培養(yǎng)基中的NO3--N消耗殆盡；當培養(yǎng)基中硝酸鉀的初始濃度為2.5、5、10g·L-1時，培養(yǎng)4d后剩余NO3--N的濃度分別為0.448、3.024、7.771g·L-1。綜合考慮，硝酸鉀的最佳濃度為1.25g·L-1。

圖10 硝酸鉀濃度對葉黃素產(chǎn)量的影響Fig.10 The effect of nitrogen concentration on the lutein yield

圖11 不同初始pH時，pH隨培養(yǎng)時間的變化Fig.11 The variation of pH under different original pHs

2.5 初始pH對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

由圖11可以看出，雖然培養(yǎng)基中的初始pH不同，但小球藻可在初始培養(yǎng)階段，自動調(diào)整至相當水平，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢；這是由于培養(yǎng)基中的氮源為硝酸鉀，小球藻在吸收的過程中伴隨質(zhì)子共轉(zhuǎn)運，使培養(yǎng)基中質(zhì)子濃度降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH上升[22]。

由圖12可以看出，雖然初始pH不同，但隨著培養(yǎng)時間的延長，OD540呈現(xiàn)相同的變化趨勢，最大值均出現(xiàn)在第3d。培養(yǎng)液的初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0時均利于小球藻的生長，并且最終的生物量差別不大。初始pH為6.0時的OD540最大，為17.1。當初始pH為8.0時，經(jīng)過115℃15min滅菌后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)淡黃色，不利于實驗結(jié)果的觀察。而且不同初始pH時，最后的葉黃素濃度均在7.98～8.3mg·L-1的范圍，故初始pH選擇6.0為佳。

圖12 不同初始pH條件下，OD隨培養(yǎng)時間的變化Fig.12 The variation of OD under different original pHs

2.6 不同溫度對小球藻生長狀況及葉黃素產(chǎn)量的影響

為了研究溫度對這株小球藻生長及葉黃素產(chǎn)量的影響，本實驗選取20、25、28、30、34、37℃六個溫度，培養(yǎng)時間為5d。由圖13可以看出，在設(shè)置的溫度范圍內(nèi)，較高的溫度，延遲期短，細胞內(nèi)酶活性強，代謝旺盛。溫度較低時（20、25℃）細胞內(nèi)酶活性低、代謝遲緩，延滯期長，達到最大生物量所需的之間較長。當培養(yǎng)溫度為20℃時，培養(yǎng)5d后OD540最大為16.57；當培養(yǎng)溫度為25℃和28℃時，4d生物量達最大，OD540分別為14.92、14.97；當培養(yǎng)溫度為30℃時，2d后生物量達到最大，OD540為16.00。當培養(yǎng)溫度為34℃和37℃時，三個平行中均有一個在培養(yǎng)初期出現(xiàn)了生長抑制現(xiàn)象，后期生長迅速，并于第3d達到相當水平。當培養(yǎng)溫度為20～30℃范圍內(nèi)，藻細胞的生長速率隨溫度的升高而增大，在30～37℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而降低，并有生長抑制現(xiàn)象發(fā)生。從以上結(jié)果看，30℃的培養(yǎng)溫度較適宜小球藻chlorella sp.生長。

圖13 溫度對小球藻生長的影響Fig.13 Effect of temperature on growth of chlorella sp.

圖14 不同溫度下，培養(yǎng)后期葉黃素在微藻細胞中的演變規(guī)律Fig.14 Lutein evolution in microalgae in late culture stage under different temperatures

由圖14可以看出，在各個培養(yǎng)溫度下，葉黃素的濃度均在第4d達最大，其中培養(yǎng)溫度為30℃時最大為12.27mg·L-1。所以，小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的最佳溫度為30℃。

3 結(jié)論

對影響小球藻Chlorella sp.生長和葉黃素產(chǎn)量的幾個關(guān)鍵因子進行了單因素影響實驗，結(jié)果表明：

3.1與乙酸鈉、甲醇相比，葡萄糖是支持小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的最佳碳源，最適濃度為20g·L-1。

3.2與尿素、氯化銨相比，硝酸鉀是支持小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的最佳氮源，最適濃度為1.25g·L-1。

3.3初始pH5.0～9.0范圍對葉黃素的產(chǎn)量無明顯影響，小球藻Chlorella sp.最適生長的初始pH為6.0。

3.430℃不僅是小球藻快速生長的最佳溫度，而且是促進小球藻生物合成葉黃素的最適溫度。

在葡萄糖濃度20g·L-1、硝酸鉀濃度1.25g·L-1，初始pH6.0，溫度30℃的培養(yǎng)條件下葉黃素的產(chǎn)量為12.27mg·L-1。

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Optimization of heterotrophic culture conditions of Chlorella sp.for lutein production

WANG Shu-hui1，2，LIN He-tong1，WANG Liang2，*，CAO Li-li3
（1.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China；
3.Shanghai Investment Consulting Corporation，Shanghai 200003，China）

The effect of carbon source，nitrogen source，pH as well as temperature on the growth of a self-isolated Chlorella sp.and the production of lutein were investigated.Results showed that glucose was the best carbon source and potassium nitrate was the best nitrogen source to support sustained and rapid growth of this strain of Chlorella sp.as well as lutein production.Results of optimization were as follows：the glucose concentration was 20g·L-1，potassium nitrate concentration was 1.25g·L-1，initial pH was 6.0 and temperature was 30℃.In this condition the maximal lutein concentration was 12.27mg·L-1.

Chlorella sp.；heterotrophic culture；lutein；carbon source；nitrogen source

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0179-06

2013－07－04 *通訊聯(lián)系人

王淑慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品貯藏保鮮原理與應(yīng)用。

國家自然科學(xué)基金（51208305）；上海市科委浦江人才計劃項目（13PJ1407600）。