復(fù)合酶制劑羊飼料添加劑中纖維素酶和淀粉酶影響因素的研究

李忠玲，徐升運(yùn)，李文孝，李本光，岳淑寧，張紅艷，趙文娟，付博

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西西安710600）

復(fù)合酶制劑羊飼料添加劑中纖維素酶和淀粉酶影響因素的研究

李忠玲1，徐升運(yùn)1，李文孝1，李本光2，岳淑寧2，張紅艷1，趙文娟2，付博2

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，陜西西安710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西西安710600）

研究了蛋白酶對纖維素酶、淀粉酶活力的影響，結(jié)果表明淀粉酶對蛋白酶比較敏感，淀粉酶在質(zhì)量濃度為150 U/mL的蛋白酶條件下37℃處理30 min，相對酶活力為75.79%。研究了纖維素酶和淀粉酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明與纖維素酶相比，淀粉酶對高溫更敏感，淀粉酶在100℃的沸水中處理1 min，相對酶活力為1.89%。研究了金屬離子對纖維素酶和淀粉酶的影響，結(jié)果表明，對于纖維素酶激活作用大小順序依次為Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+，抑制作用大小順序依次為Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+；對于淀粉酶激活作用不明顯,抑制作用大小順序依次為Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。以上研究的目的是為酶在飼料中的應(yīng)用提供參考。

纖維素酶；淀粉酶；酶制劑；飼料添加劑

酶是由生物的活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的蛋白質(zhì)，只要不處于變性狀態(tài)，無論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外都可發(fā)揮催化化學(xué)反應(yīng)的作用[1]。生物酶制劑對于飼料工業(yè)的發(fā)展起到了極大的促進(jìn)作用[2]。飼用酶制劑一直是飼料添加劑領(lǐng)域最為引人關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一，其的應(yīng)用對于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能與福利、改善飼料資源利用效率、減少環(huán)境污染發(fā)揮巨大作用，對于促進(jìn)飼料行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用[3]。相關(guān)研究較多，周曉娟等[4]在日糧中添加復(fù)合酶，試驗(yàn)組每天每頭奶牛比對照組多盈利3.88元；杜忍讓等[5]研究不同日糧酶制劑水平對奶牛產(chǎn)奶性能的影響表明，試驗(yàn)組奶牛日均產(chǎn)奶量比對照組提高3.64 kg/d，增加了12.22%；劉成更等[6]進(jìn)行復(fù)合酶飼料添加劑對荷斯坦乳牛的飼喂試驗(yàn)表明，在奶牛飼料中添加復(fù)合酶飼料添加劑可使乳產(chǎn)量提高7.62%，乳成分有所改善，乳脂率提高10%，該添加劑對乳房炎有一定治療作用，可使體細(xì)胞數(shù)明顯下降。杜忍讓等[7]用復(fù)合酶制劑飼喂青年羊，經(jīng)濟(jì)效益比對照組多收益34.08元/只；張琨[8]的研究表明，復(fù)合酶制劑可提高產(chǎn)奶量59.09%。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此酶具有蛋白質(zhì)的一般特性，即具有高分子量、兩性電解質(zhì)、不耐熱性等，一切使蛋白質(zhì)變性的因素如熱、紫外線、X射線、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子等都可以破壞其結(jié)構(gòu)而變性[9]。本研究對自制的復(fù)合酶制劑羊飼料添加劑中纖維素酶和淀粉酶影響因素進(jìn)行考察，以期為酶制劑的穩(wěn)定性研究及在飼料工業(yè)中的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

飼用復(fù)合酶（主要酶組分為蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶等）：陜西省科學(xué)院酶工程研究所自行研制。

1.2 儀器與設(shè)備

752N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH.W21.600S數(shù)顯電熱恒溫水溫箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；800B臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DH-101-2PS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

1.3 方法

蛋白酶活力測定：Folin顯色法（QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》）[9]；纖維素酶活力測定：DNS法（QB 2583—2003《纖維素酶制劑》）[10]；淀粉酶活力測定：比色法（GB 8275—2009《食品添加劑α-淀粉酶制劑》）[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶對主要酶制劑的影響

因?yàn)槊傅谋举|(zhì)是蛋白質(zhì)，所以酶在蛋白酶的作用下會(huì)不同程度的發(fā)生降解，從而影響了酶的空間構(gòu)象，最終影響酶的活性。本試驗(yàn)研究了蛋白酶對主要酶制劑中的纖維素酶和淀粉酶活性的影響。

2.1.1 蛋白酶對淀粉酶的影響

淀粉酶分別用不同酶活的蛋白酶（50 U/mL、100 U/mL、150 U/mL）于37℃分別處理不同時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），取出稀釋相應(yīng)的倍數(shù)測淀粉酶活力，結(jié)果見圖1。

圖1 蛋白酶對淀粉酶的影響Fig.1 Effects of protease on amylase activity

隨著處理時(shí)間的延長，淀粉酶活性不斷下降。當(dāng)?shù)鞍酌该富顬?0 U/mL時(shí)相對酶活力在60 min時(shí)降至92.96%；當(dāng)?shù)鞍酌该富顬?00 U/mL時(shí)相對酶活力在60 min時(shí)降至61.06%；當(dāng)?shù)鞍酌该富顬?50 U/mL時(shí)相對酶活力在60 min時(shí)降至60.15%。可以看出，隨著蛋白酶酶活的增加，淀粉酶活力的降低速度加快，從而得出結(jié)論，淀粉酶對蛋白酶比較敏感。但從圖1的曲線來看，當(dāng)?shù)鞍酌该富钤鲋?50 U/mL時(shí)，淀粉酶相對活力下降的速度與蛋白酶酶活為100 U/mL時(shí)相比有放緩的趨勢。

2.1.2 蛋白酶對纖維素酶的影響

纖維素酶分別用不同酶活的蛋白酶（0～1 000 U/mL）于37℃處理30 min，取出稀釋相應(yīng)的倍數(shù)測纖維素酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白酶對纖維素酶活力的影響Fig.2 Effects of protease on cellulase activity

從圖2可以看出，總的趨勢是隨著蛋白酶酶活的增加，纖維素酶活力的降低速度加快。但在蛋白酶酶活為300 U/mL和400 U/mL時(shí)纖維素酶活力略有提高，可能是在該蛋白酶酶活的作用下原來已經(jīng)失去活性的酶分子活性中心重新暴露出來而顯示了酶活性，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

比較圖1和圖2，從圖1看出，淀粉酶在蛋白酶酶活為150 U/mL的條件下處理30 min，相對酶活力為75.79%。從圖2看出，纖維素酶在的蛋白酶酶活為200 U/mL的條件下處理30 min，殘余酶活力為99.88%。纖維素酶在蛋白酶酶活為1 000 U/mL的條件下處理30 min，殘余酶活力為87.39%，明顯高于淀粉酶。從比較得出，在相同蛋白酶酶活條件下處理相同時(shí)間，淀粉酶相對較為敏感。

2.2 纖維素酶和淀粉酶的耐高溫性能

酶是蛋白質(zhì)，其三級結(jié)構(gòu)是酶的物理性質(zhì)催化作用的根源。所有蛋白質(zhì)被加熱能破壞其三級結(jié)構(gòu)。隨著溫度的升高，最終蛋白質(zhì)被徹底破壞，酶不再起催化作用[12]。羊是草食動(dòng)物，飼料中纖維含量較高，所以飼料添加劑中纖維素酶占主要成分。本研究對纖維素酶和淀粉酶的耐高溫性能進(jìn)行了測定。

2.2.1 溫度對纖維素酶的影響

將纖維素酶溶解過濾，濾液分別在50～100℃處理30 min，酶液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)測定纖維素酶殘余酶活力，結(jié)果見圖3。從圖3可知，在50～70℃酶活力幾乎呈直線下降趨勢，相對酶活力從79.44%降低至11.72%。70℃之后下降趨勢放緩，在70～100℃相對酶活力從11.72%降低至2.82%，說明該纖維素酶不宜在高于50℃條件下使用。

2.2.2 纖維素酶在高溫條件下的熱穩(wěn)定性

將纖維素酶溶解過濾，濾液分別在90℃和100℃處理0～30 min，酶液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)測定纖維素酶殘余酶活力，結(jié)果見圖4。

圖3 溫度對纖維素酶活力的影響Fig．3 Effects of temperature on cellulase activity

圖4 高溫對纖維素酶活力的影響(0～30 min)Fig．4 Effects of high temperature on cellulose activity(0-30 min)

從圖4可知，在90℃和100℃條件下，纖維素酶活性下降非常快，在5 min時(shí)，90℃條件下相對酶活力為6.36%，100℃條件下相對酶活力為4.65%。之后下降趨勢趨于平緩，100℃保溫30 min，纖維素酶仍有2.82%的酶活性殘余，這些殘余的酶抵抗高溫的機(jī)理及如何進(jìn)一步提高酶的熱穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。從圖4可知，纖維素酶在前5 min活力迅速下降，為了更清楚的反映酶活力的下降過程，對前10 min酶活性下降趨勢進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖5。從圖5可知，在90℃條件下處理1 min，酶活力下降至46.18%，在90℃條件下處理2 min，酶活力下降至16.64%。在100℃條件下處理1 min，酶活力下降至6.29%。這說明飼料工藝中的高溫造粒對酶制劑不適用。

圖5 高溫對纖維素酶活力的影響(0～10 min)Fig．5 Effects of high temperature on cellulose activity(0-10 min)

2.2.3 高溫對淀粉酶的影響

將淀粉酶溶液置于100℃的沸水中，處理0～10 min，測定殘余的酶活力，計(jì)算酶活力相對值，結(jié)果見表1。

表1 高溫對淀粉酶活力的影響Table 1 Effects of high temperature on amylase activity

從表1可知，淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相對酶活力為1.89%，放置2 min后因酶活力過低而未檢出。從加熱過程的現(xiàn)象來看，高溫處理會(huì)使淀粉酶分子變性絮凝，失去酶活性。從淡黃色的酶液放入沸水中開始，就開始有絮凝出現(xiàn)，而且隨著時(shí)間的延長絮凝物增多，到5 min時(shí)絮凝物聚集成團(tuán)狀，液體變?yōu)闊o色清亮狀，表示酶分子已基本絮凝完全。

從圖5和表1可知，纖維素酶在100℃的沸水中放置1 min，相對酶活力為4.65%，在放置10 min時(shí)相對酶活力為2.82%。而淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相對酶活力為1.89%，放置2 min后因酶活力過低而未檢出?？梢?，與纖維素酶相比，淀粉酶對高溫更敏感。

2.3 飼料中其他添加成分對酶制劑的影響

2.3.1 NaCl對淀粉酶的影響

淀粉酶分別用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液（0～35%）于37℃處理30 min，取出稀釋相應(yīng)的倍數(shù)測淀粉酶活力，結(jié)果見圖6。

圖6 NaCl對淀粉酶活力的影響Fig．6 Effects of NaCl on amylase activity

從圖6可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜10%時(shí)對淀粉酶基本無影響，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞10%時(shí)，淀粉酶隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加活性下降，但下降的趨勢較緩。

2.3.2 麥飯石對淀粉酶的影響

分別稱淀粉酶1.0g，加入麥飯石粉0g、0.5g、1.0g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g、3.5 g、4.0 g，攪拌，定容至100 mL，搖勻，放置30 min，過濾，將濾液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)進(jìn)行淀粉酶活力測定，結(jié)果見圖7。

圖7 麥飯石對淀粉酶活力的影響Fig.7 Effects of medical stone on amylase activity

從圖7可知，麥飯石對淀粉酶有影響，隨著麥飯石添加量的增加，淀粉酶活力表現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是因?yàn)辂滐埵奈阶饔迷斐傻摹?/p>

2.4 金屬離子對纖維素酶活力和淀粉酶活力的影響

金屬離子對酶的影響往往與酸催化的影響相似，而且作用很強(qiáng)。金屬離子還可參加氧化還原反應(yīng)，作用是多方面的[14]。也可能是因?yàn)殡x子的電負(fù)性，對酶產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。

取1 g飼料復(fù)合酶，用相應(yīng)緩沖液充分溶解并浸提30 min后定容，經(jīng)四層脫脂紗布過濾，濾液保存至0～4℃冰箱內(nèi)備用，使用時(shí)稀釋一定倍數(shù)。用蒸餾水配制一定摩爾濃度的金屬離子溶液，用時(shí)稀釋至需要的濃度。用等體積蒸餾水代替離子溶液作空白，測定酶液在不同離子濃度條件下37℃保溫30 min后的相對酶活力。

2.4.1 金屬離子對纖維素酶活力的影響

研究了5種金屬離子對纖維素酶活力的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同金屬離子對纖維素酶活力的影響Table 2 Effects of different metal ions on cellulase activity

由表2可見，5種金屬離子在低濃度條件下對酶的活性普遍無明顯影響，但隨著濃度的增加，不同金屬離子對酶活性的影響越來越明顯。從單個(gè)金屬離子來分析，Cu2+在不同濃度條件下對纖維素酶都表現(xiàn)出激活作用，在10-3mol/L濃度下對酶活的激活作用最大，可使相對酶活力達(dá)到132.45%；Cu2+的激活作用可能是它能使底物更有利于與酶的活性部位相結(jié)合而加速反應(yīng)進(jìn)行[15]。Fe2+在低濃度條件下對酶活無明顯影響，但當(dāng)濃度繼續(xù)增大到10-2mol/L后，酶活喪失較大，相對酶活為88.98%；Zn2+的影響趨勢是隨著濃度的增加激活作用加大，在10-2mol/L濃度條件下可使相對酶活力達(dá)到110.03%；Mn2+的影響趨勢與Zn2+相反，隨著濃度的增加抑制作用加大，并且其抑制作用明顯大于Fe2+，在10-2mol/L濃度條件下可使相對酶活力降低到68.73%；Co2+隨著濃度的增加激活作用加大，在10-3mol/L濃度條件下達(dá)到最大，為112.09%，之后開始下降，在10-2mol/L濃度條件下表現(xiàn)為抑制作用?？傮w來說，金屬離子對于纖維素酶激活作用大小順序依次為Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+，抑制作用大小順序依次為Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+。

2.4.2 金屬離子對淀粉酶活力的影響

研究了5種金屬離子對淀粉酶活力的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同金屬離子對淀粉酶活力的影響Table 3 Effects of different metal ions on amylase activity

由表3可見，5種金屬離子在低濃度條件下對酶的活性普遍無明顯影響，但隨著濃度的增加，不同金屬離子均對酶活性產(chǎn)生了抑制作用。從單個(gè)金屬離子來分析，Cu2+在不同濃度下對纖維素酶都表現(xiàn)出抑制作用，在10-2mol/L濃度條件下可使相對酶活力降低到84.27%；Fe2+在低濃度條件下對酶活無明顯影響，但當(dāng)濃度繼續(xù)增大到10-2mol/L后，相對酶活為83.18%；Zn2+、Mn2+、Co2+的影響均不明顯，但總趨勢也是隨著濃度的增加抑制作用加大，在10-2mol/L濃度條件下相對酶活分別為97.94%、96.83%、97.92%?？傮w來說，金屬離子對于淀粉酶激活作用不明顯，抑制作用大小順序依次為Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。

3 結(jié)論

通過研究蛋白酶對纖維素酶、淀粉酶活力的影響發(fā)現(xiàn)，淀粉酶在濃度為150 U/mL的蛋白酶條件下處理30 min，相對酶活力為75.79%，纖維素酶在濃度為200 U/mL的蛋白酶條件下處理30 min，殘余酶活力為99.88%。纖維素酶在濃度為1 000 U/mL的蛋白酶條件下處理30 min，相對酶活力為87.39%，明顯高于淀粉酶。從比較得出：在相同蛋白酶濃度條件下處理相同時(shí)間，淀粉酶相對較為敏感。通過研究纖維素酶、淀粉酶活力的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在100℃的沸水中放置1 min，相對酶活力為4.65%，在放置10 min時(shí)相對酶活力為2.82%。而淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相對酶活力為1.89%，放置2 min后因酶活力過低而未檢出。可見，與纖維素酶相比，淀粉酶對高溫更敏感。通過研究NaCl與麥飯石對淀粉酶的影響發(fā)現(xiàn)，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜10%時(shí)對淀粉酶基本無影響，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞10%時(shí)，淀粉酶隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加活性下降，但下降的趨勢較緩；麥飯石對淀粉酶的影響不大，但隨著麥飯石添加量的增加，淀粉酶表現(xiàn)出活力下降的趨勢。通過研究金屬離子對纖維素酶活力的影響發(fā)現(xiàn)，不同金屬離子在不同的濃度下對自行研制的飼料復(fù)合酶中纖維素酶的活力影響有很大不同?？傮w來說，對于纖維素酶激活作用大小順序依次為Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+。抑制作用大小順序依次為Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+；對于淀粉酶激活作用不明顯，抑制作用大小順序依次為Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。

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Influence factors of cellulase and amylase of compound enzyme preparation in sheep feed additive

LI Zhongling1,XU Shengyun1,LI Wenxiao1,LI Benguang2,YUE Shuning2,ZHANG Hongyan1,ZHAO Wenjuan2,FU Bo2
(1.Institute of Enzyme Engineering,Shaanxi Province Academy of Sciences,Xi'an,710600,China; 2.Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi Province,Xi'an,710600,China)

The effect of protease on the activity of cellulase and amylase was studied,and result showed that amylase was more sensitive to protease than cellulase.The relative enzymatic activity of amylase was 75.79%when treated in 150 u/ml protease at 37℃for 30 min.The thermostabilities of cellulase and amylase were tested and the results showed that amylase was more sensitive to high temperature than cellulase.The relative enzyme activity of amylase was 1.89%when treated in 100℃water for 1 min.Effects of different metal ions on the activity of cellulase and amylase were tested and the results showed that activation effect on cellulase ranked in order was Cu2+,Zn2+,Co2+,Mn2+and Fe2+,the inhibition effect on cellulase ranked in order was Mn2+,Fe2+,Co2+,Zn2+and Cu2+.Activation effect on amylase was not distinct and inhibition effect on amylase ranked in order was Fe2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+and Co2+.The research purpose was to provide a convenient reference for further research about enzyme applications to feed.

cellulase;amylase;enzyme preparation;feed additive

S816.7

A

0254-5071（2014）11-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.019

2014-09-05

陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2012K-15）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程難題攻關(guān)項(xiàng)目（2013KTZB02-02-02）

李忠玲（1973-），女，副研究員，碩士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。