赤水丹霞山土壤來源抗菌活性鏈霉菌的分離及放線菌素產(chǎn)生鏈霉菌Streptomycessp.CSDX001發(fā)酵產(chǎn)物分析

岳昌武，李園園，黃兵，羅顯濤，邵美云，王苗，保玉心，黃英

（1.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省微生物資源及藥物開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563003；2.中國科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101）

赤水丹霞山土壤來源抗菌活性鏈霉菌的分離及放線菌素產(chǎn)生鏈霉菌Streptomycessp.CSDX001發(fā)酵產(chǎn)物分析

岳昌武1，2，李園園1，黃兵2，羅顯濤1，邵美云1，王苗1，保玉心1，黃英2

（1.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省微生物資源及藥物開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563003；2.中國科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101）

分離、鑒定赤水丹霞地區(qū)土壤來源的抗臨床耐藥菌活性的鏈霉菌。采集赤水丹霞山區(qū)不同海拔的土樣并利用多種培養(yǎng)基分離、純化菌株。熱酚法提取菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因并測序后在線比對以確定其系統(tǒng)分類學(xué)地位。利用多種測試菌測試抗菌活性，通過HPLC和LC/MS分析菌株發(fā)酵抽提物并與數(shù)據(jù)庫比較。分離得到菌株600株，其中59株鏈霉菌中有41株具有1種以上的抗測試菌活性。Streptomycetessp.CSDX001具有抗耐藥耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、抗耐萬古霉素金黃色葡萄球菌、抗多藥耐藥鮑曼不動桿菌、抗枯草芽孢桿菌、抗藤黃微球菌、抗白色念球菌的活性，具有抗多種微生物的活性和產(chǎn)生多種新結(jié)構(gòu)次級代謝產(chǎn)物潛力，可能是抗微生物新天然活性產(chǎn)物的重要來源。

鏈霉菌；抗菌活性；16S rRNA；次級代謝產(chǎn)物

放線菌是抗生素的主要產(chǎn)生菌，來源于放線菌的抗生素類天然產(chǎn)物超過10 000種，這其中3/4以上的天然產(chǎn)物來自鏈霉菌，是微生物來源抗生素類物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌[1-3]。從特殊環(huán)境和典型生態(tài)環(huán)境中分離得到具有開發(fā)價(jià)值的新菌株和新的天然產(chǎn)物的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于受人類活動影響較大的普通生態(tài)環(huán)境[4-7]，如孫承航等[8-9]在塔克拉瑪干沙漠南麓土壤及羅布泊地區(qū)沙生植物根際分離得到大量的可能產(chǎn)生新活性產(chǎn)物的抗菌活性放線菌。黃英[10]從南海深海海水分離出的海洋鏈霉菌Streptomyces olivaceusFXJ 8.012分離抗病原性Klebsiella pneumoniae新的化合物Tetroazolemycins A and B。

貴州很多地區(qū)保留了其獨(dú)特的原生態(tài)環(huán)境，這些原生態(tài)環(huán)境中可能孕育著新的特殊的微生物資源，具有從中開發(fā)微生物抗菌藥物的巨大潛力，值得進(jìn)一步研究[11]。本試驗(yàn)通過對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）和液質(zhì)聯(lián)用（chromatography/massspectrometry，LC/MS）分析并與已知數(shù)據(jù)庫比較，從赤水丹霞地區(qū)土壤中分離41株有抗菌活性的的鏈霉菌分離菌株，其中1株產(chǎn)放線菌素C2/放線菌素D的鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001，該菌除了產(chǎn)放線菌素外，還具有很強(qiáng)的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床分離株、抗耐萬古霉素金黃色葡萄球菌、抗多藥耐藥鮑曼不動桿菌、抗枯草芽孢桿菌、抗藤黃微球菌、抗白色念珠菌活性，并可產(chǎn)生多種新結(jié)構(gòu)次級代謝產(chǎn)物，是值得進(jìn)一步開發(fā)利用的菌株資源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

土樣采集：300份試驗(yàn)土樣采集于貴州省赤水丹霞山區(qū)海拔600 m左右的除地表腐殖質(zhì)的10～20 cm土層，分裝于無菌樣品采集袋中常溫保存運(yùn)輸。

分離培養(yǎng)基：菌種分離主要利用高氏1號培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，加雙蒸水定容至1 L）、自來水酵母粉瓊脂培養(yǎng)基（酵母浸汁0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18 g，加雙蒸水定容至1 L）和GYM（glucose yeast extract maltextract）固體培養(yǎng)基（葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂粉15 g，加雙蒸水定容至1 L）。

抗菌測試菌：多藥耐藥耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（耐藥譜：甲氧西林、氨芐西林、紅霉素、林可霉素、青霉素、四環(huán)素）、多藥耐藥鮑曼不動桿菌臨床分離株（耐藥譜：氨芐西林、左氧氟沙星、氨芐新林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢替坦、呋喃妥因、慶大霉素、泰能霉素、妥布霉素）為遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室陳澤慧教授提供。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（MicrococcusluteusCGMCC1.2156）、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等菌株均由微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：抗菌藥物及抗生素（抗菌劑儲液：制霉菌素20 mg/L，重鉻酸鉀50 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L）：Sigma公司；酚/氯仿等DNA提取試劑：北京索萊寶公司；常規(guī)生化試劑（分析純）：成都科龍化工試劑廠；分子生物學(xué)試劑及酶類：大連寶生物公司；1 000×微量元素預(yù)混液（ZnSO4·7H2O 2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g，MnCl2·4H2O 2 g，CuSO4·5H2O 2 g，Na2B4O7·10H2O 2 g，（NH4）6Mo7O24· 4H2O 2 g加水定容至1 L）；培養(yǎng)基：碧迪生物上海公司。

1.2儀器與設(shè)備

Hitachi SU8010冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；Agilent 1220LC System VL高效液相色譜系統(tǒng)：美國安捷倫公司；1200HPLC/6520QTOFMS液質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；HC-518R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DZ-900英培搖床：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步其公司；BSP-400培養(yǎng)箱：上海博訊設(shè)備儀器廠；E002092超級潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株分離及形態(tài)觀察

分別稱取每份樣品2 g于無菌研缽中，加入0.2 g（土樣重量的1/10）CaCO3，用無菌杵研磨成細(xì)粉，裝入50 mL無菌離心管，28℃風(fēng)干14 d，加入30 mL無菌水，在28℃搖床充分振蕩1 h充分懸浮，55℃靜置處理20 min，促使放線菌孢子萌發(fā)。采用梯度稀釋法將土壤預(yù)混液分別梯度稀釋成10-1、10-2和10-3等3個(gè)濃度梯度，振蕩混勻后及時(shí)吸取200 μL土樣懸濁液分別均勻涂布于固體分離培養(yǎng)基平板，28℃靜置培養(yǎng)，隨時(shí)觀察培養(yǎng)基上的菌落狀態(tài)，挑取疑似放線菌形態(tài)的目的菌株單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)[1]。電鏡觀察在中科院微生物研究所大型儀器中心進(jìn)行，主要步驟：2.5%戊二醛固定過夜，雙蒸水漂洗3次，每次8 min；依次用體積分?jǐn)?shù)為50%-70%-85%-95%的乙醇梯度脫水15 min，然后用體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇脫水三次，每次15 min；然后利用BAL-TEC CPD030進(jìn)行二氧化碳臨界點(diǎn)干燥；BAL-TEC SCD005離子濺射儀噴金后利用FEI QUANTA 200掃描電鏡觀察。

1.3.2次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵

接種環(huán)挑取一環(huán)活性菌株接種于裝有100 mL GYM發(fā)酵液體培養(yǎng)基（ISP2+1 mL微量元素預(yù)混液，加入去離子水定容至1 L溶液）的500 mL錐形瓶中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)215 h，菌體連同培養(yǎng)基加入100 mL乙酸乙酯，150 r/min、28℃振搖30 min充分萃取，靜置10 min，取上層乙酸乙酯層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，38℃蒸干，加入1 mL甲醇重溶抽提物，用于活性測試和化合物結(jié)構(gòu)初步分析。

1.3.3發(fā)酵產(chǎn)物活性測試

將多藥耐藥金葡菌、多藥耐藥銅綠假單孢菌、耐藥腸桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌分別接種LB液體培養(yǎng)基，28℃搖床200 r/min培養(yǎng)6～8 h，白色念球菌接種GYM液體培養(yǎng)基，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)6～8 h。取30 mL新鮮菌液與70 mL將凝固（約45℃）的相應(yīng)固體培養(yǎng)基分別混勻后迅速倒板，待培養(yǎng)基凝固后用無菌打孔器打直徑為5 mm孔，分別吸取50 μL抽提產(chǎn)物于孔中。多藥耐藥金葡菌、多藥耐藥銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌等測試平板置于37℃過夜培養(yǎng)。根據(jù)抑菌圈的有無及大小判定抗菌活性的強(qiáng)弱。

1.3.416S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將篩選得到的活性菌株利用經(jīng)典溶菌酶/SDS結(jié)合酚/氯仿法提取基因組總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物序列27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應(yīng)條件為：50 μL反應(yīng)體系94℃，預(yù)變性5 min；PCR熱循環(huán)程序?yàn)?4℃變性0.5 min，56℃退火0.5 min，72℃延伸1.5 min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后72℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。16SrRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海立菲生物公司完成。根據(jù)測序結(jié)果，將16S rRNA序列用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast程序[9]在線進(jìn)行序列相似性比對搜索，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作為參比對象，采用MEGA5.0軟件進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12-15]。

1.3.5發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC及LC/MS分析

色譜條件：InertsilODS-3液相色譜柱（4.6mm×150mm，5 μm），進(jìn)樣量：20 μL，流速1 mL/min，甲醇∶水（80∶20）梯度洗脫。粗產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC（ShimadzuSPD-M20A，色譜柱：ODS，10×150 mm）進(jìn)一步純化，通過HRESI-MS（Waters Xevo G2 QTof）來鑒定化合物。

2　結(jié)果與分析

2.1活性菌株的分離

圖1　Streptomycetessp.CSDX001發(fā)酵產(chǎn)物抗臨床多藥耐藥菌活性分析Fig.1 Activity analysis ofStreptomycetessp.CSDX001 fermentation products against multi-drug resistance bacteria

表1　分離菌株抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of isolated strains

采集了43份土壤樣品，從中分離到600株菌，根據(jù)形態(tài)初步排重后選取其中59株鏈霉菌形態(tài)的菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序及序列分析，將其獲發(fā)酵液乙酸乙酯萃取濃縮物進(jìn)行抗菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)有41株鏈霉菌分離菌株有至少1種以上的抗菌活性，活性菌株占測活菌株總數(shù)的69.5%。其中Streptomycetessp.CSDX001表現(xiàn)出廣譜的抗測試菌的活力（見表1）。臨床分離菌株測活結(jié)果表明Streptomycetessp.CSDX001具有很強(qiáng)的抗多藥耐藥耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（抑菌圈約直徑1cm）、多藥耐藥銅綠假單孢菌臨床分離菌株的活性（抑菌圈直徑＞3cm）（見圖1）。

2.2鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001形態(tài)特征

28℃分純培養(yǎng)的Streptomycetessp.CSDX001菌落質(zhì)地緊密，氣絲發(fā)達(dá)，呈粉狀，營養(yǎng)菌絲與培養(yǎng)基緊密結(jié)合，菌落產(chǎn)生黃色色素，背面呈褐色，成熟時(shí)產(chǎn)生灰色孢子（見圖2A）。5 000倍電鏡下觀察Streptomycetessp.CSDX0010氣生菌絲發(fā)達(dá)，孢子較少，基內(nèi)菌絲有分支，菌絲無橫隔，不斷裂，孢子絲直或柔曲，孢子表面有疣，具備典型的鏈霉菌電鏡形態(tài)特征（見圖2B）[1]。

圖2　Streptomycetessp.CSDX001形態(tài)特征Fig.2 Morphological characters ofStreptomycetessp.CSDX001

2.3Streptomycetessp.CSDX001 16S rRNA分子分類

利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F/1492R擴(kuò)增得到約1 450 bp的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物過柱純化后利用該引物測序，測序結(jié)果拼接后得到1 390 bp核酸序列，利用該序列在線Blast，結(jié)果表明，Streptomycetessp.CSDX001 16S rRNA與鏈霉菌（Streptomyces griseoluteus）P510的16S rRNA同源性達(dá)97%，提示該菌可能屬于Streptomyces griseoluteus類群中的一個(gè)比較新的種（見圖3）。

圖3　Streptomycetessp.CSDX001 16S rRNA同源樹Fig.3 Phylogenetic analysis ofStreptomycetes sp.CSDX001 16S rRNA

2.4鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001次級代謝潛力分析

對鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001進(jìn)行小量發(fā)酵，乙酸乙酯抽提產(chǎn)物利用HPLC分析結(jié)果表明，該菌具有豐富的次級代謝產(chǎn)物，LC/MS分析結(jié)果表明，該菌產(chǎn)生放線菌素C2和放線菌素D（見圖4），此外該菌的還產(chǎn)生天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（http：//db.sgst.cn/intersdb；http：//scdb/default.asp；http：//naturalprod.ucsd.edu/；www.pharmdata.ac.cn/China TACW.asp；microbial natural products database，MNPD等）里沒有的紫外吸收特征的分子式可能分別為C23H36O7、C24H38O7和C23H36O6的3個(gè)化合物，其相應(yīng)的紫外光譜及質(zhì)譜圖（見圖5）提示這三個(gè)化合物可能是同系物。

圖4　鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001產(chǎn)放線菌素LC/MS分析Fig.4 LC/MS analysis of actinomycins producted byStreptomycetessp.CSDX001

圖5　鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001產(chǎn)疑似新化合物L(fēng)C/MS分析Fig.5 LC/MS analysis of suspected new compounds produced byStreptomycetessp.CSDX001

3　討論

臨床上對耐藥金黃色葡萄球菌、多藥耐藥銅綠假單孢菌、耐藥腸桿菌屬及白色念珠菌等感染缺乏有效的抗生素藥物治療[16-20]，從特殊環(huán)境中分離新的來源的鏈霉菌可為解決這些難題提供物質(zhì)基礎(chǔ)[21-24]。貴州省境內(nèi)蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，具有很大的開發(fā)潛力。本研究從貴州省赤水丹霞地區(qū)土壤中采集的分離獲得1株能產(chǎn)生放線菌素C2/放線菌素D的鏈霉菌Streptomycetessp.CSDX001，該菌除了能產(chǎn)生放線菌素外，還具有很強(qiáng)的抗耐藥金黃葡萄球菌、多藥耐藥銅綠假單孢菌、抗枯草芽孢桿菌、抗藤黃微球菌及抗白色念球菌活性。此外，該菌可產(chǎn)生多種新結(jié)構(gòu)次級代謝產(chǎn)物，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。后期對于該菌的研究主要集中在疑似新化合物的發(fā)酵條件的優(yōu)化、化合物純化及結(jié)構(gòu)解析、生物活性的確定，期望能為工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及新藥的開發(fā)提供新的天然產(chǎn)物來源。

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Isolation of antimicrobialStreptomycetesspp.from Chishui Danxia soil and fermentation product analysis of actinomycin producingStreptomycessp.CSDX001

YUE Changwu1,2,LI Yuanyuan1,HUANG Bing2,LUO Xiantao1,SHAO Meiyun1,WANG Miao1,BAO Yuxin1,HUANG Ying2
(1.Guizhou Key Laboratory of Characteristic Microbial Research&Drug Development,Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China; 2.State Key Laboratory of Microbial Resources,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China)

In order to isolate and identify theStreptomycetesspp.with antimicrobial activity from Chishui Danxia region,the soil samples from different altitudes was collected,and then isolated and purified by a variety of medium.The strain gene DNA was extracted by hot phenol method,16S rRNA PCR products was sequenced and blasted online for determine the phylogeny of isolated strains.Antimicrobial activities were detected with multiple test bacteria,and the fermentation extracts were analyzed by HPLC and LC/MS,and the results were compared with database.Results showed that 600 strains were isolated and 41 out of 59Streptomycetesstrains had more than one antimicrobial activity.Streptomycessp.CSDX001 showed resistance activity to methicillin-resistantStaphylococcusaureus,vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,multi drug resistantAcinetobacter baumannii,Bacillus subtilis,Micrococcus luteus,Candida albicans;it showed antimicrobial activities and secondary metabolites-producing potential,which might be a potential bacterial resource for active natural products research and development.

Stretomycetesspp.;antimicrobial activity;16S rRNA;secondary metabolite

R9

A

0254-5071（2014）11-0041-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.009

2014-06-12

國家自然科學(xué)基金(31160004)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（黔教合KY字[2012]011號）；貴州省科技學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字[2010]2156號，黔科合J字[2012]2348號，黔科合SY字[2013]3013號）

岳昌武（1975-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锾烊划a(chǎn)物發(fā)現(xiàn)及生物合成。

李園園（1987-），碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锾烊划a(chǎn)物發(fā)現(xiàn)及活性機(jī)制分析。

注：以上兩人為并列第一作者。