核桃青皮提取物對幾種采后病原真菌抑制作用的研究

王剛霞，彭新媛，吳忠紅，李維霞，張正方，吳 斌，*

（1.新疆大學化學化工學院，烏魯木齊830041；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊830091；3.新疆大學理化測試中心，烏魯木齊830041）

新鮮果蔬是人體日常必需的維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維的重要來源，具有獨特的形、色、味，是人們最好的保健食品。但果蔬采后極易受到有害病原菌的侵染而腐爛變質(zhì)，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國貯運的主要果蔬因采后病害造成的損失達25%～30%[1]，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，控制果蔬采后腐爛最主要的方法仍是使用化學殺菌劑[2]，但長期使用化學藥劑易出現(xiàn)抗藥菌系而使藥效降低，同時化學藥劑具有毒性物質(zhì)殘留、致癌和致畸等問題[3]。因此，開發(fā)高效、安全、無毒和性能穩(wěn)定的天然植物防腐保鮮劑已成為果蔬采后保鮮技術(shù)的研究熱點[4-6]。

核桃（Juglans regia Linn.）是核桃屬植物中經(jīng)濟價值最高的一種，在中國栽培歷史悠久，資源豐富，具有顯著的經(jīng)濟效益和藥用價值[7]。核桃青皮為核桃未成熟時的外果皮，其性辛、苦、澀、有毒、微寒，具有抗腫瘤作用，外用于皮膚疥癬、疣等皮膚病[8]。我國核桃青皮年產(chǎn)量在35萬噸以上，但是大部分核桃青皮被作為廢棄物扔掉，造成極大的資源浪費，并嚴重污染環(huán)境[9]。為了充分利用這一資源，國內(nèi)外學者對核桃青皮提取物的抗氧化性、抑菌性、殺蟲、除草以及抗病毒等方面進行了大量研究工作[10-13]。但關于核桃青皮提取物對果蔬采后病原真菌抑制效應方面的研究報道較少。

本文以新疆核桃青皮為試材，研究核桃青皮提取物對果蔬采后腐爛主要致病真菌青霉菌（Penicillium citrinu）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、灰葡萄孢（Botryis Cinerea）、鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、交鏈孢屬（A lternaria）的抑制作用，為天然植物提取劑在果蔬采后保鮮上的應用和核桃青皮的再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮核桃（Juglans regia Linn.） 采自新疆吐魯番，將核桃青皮在-20℃下用植物粉碎機粉碎，在-50℃下真空冷凍干燥除去水分，過40目篩，得核桃青皮干粉，置于-80℃冰箱中備用；無水乙醇 分析純；葡萄糖、瓊脂粉 均購自上海日心食品有限公司；青霉菌（P.citrinu ACCC30287）、匍枝根霉（R.stolonifer ACCC36077）灰葡萄孢（B.cinerea ACCC36056）、鐮刀菌（F.oxysporum ACCC31371）、交鏈孢屬（Alternaria CFCC6872） 新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所。

LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司；Coulter Avanti J-25型高速冷凍離心機BECKMAN公司；FW-80型植物粉碎機 北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ID型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DHP-420型恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療器械儀器廠；Nikon H 600L型顯微鏡 上海儀圓光學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃青皮提取物的制備 將1.5g核桃青皮干粉溶解至15m L 80%乙醇溶液中，室溫條件下反應45m in，將提取液低溫（4℃）離心30m in（8000r/m in），然后真空抽濾，再將濾液45℃下旋轉(zhuǎn)蒸去乙醇，得到20%的固體濃縮物，將濃縮物用超聲波溶解在水中（做孢子萌發(fā)實驗的供試液須隔夜再過濾），配制不同濃度的供試液，置于4℃冰箱備用。

1.2.2 最低抑菌濃度（M IC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定[1]在無菌條件下，向培養(yǎng)皿里倒入9m L PDA培養(yǎng)基，再加入1m L供試液，對照組加入1m L無菌水，輕輕搖勻，制成帶藥的培養(yǎng)基，吸取待測菌種懸浮液100μL于培養(yǎng)皿表面，涂布均勻，置于28℃下培養(yǎng)48h，觀察測試菌種的生長情況，已完全沒有菌生長的最低濃度作為待測物的最低抑菌濃度MIC。把上述沒有長菌絲的雙碟平皿繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出觀察，以完全無菌生長的為最低殺菌濃度MBC。

1.2.3 核桃青皮乙醇提取物對供試菌種孢子萌發(fā)率的活性測定[14]取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6～7d的平板，用無菌葡萄糖溶液將孢子洗下，用四層紗布過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，在顯微鏡下調(diào)整其孢子含量為每視野50～60個。取載玻片，先加一滴供試液，對照組加入等量無菌葡萄糖溶液，然后再加入0.05m L的孢子懸浮液，每個處理重復3次。將玻片置于25～28℃培養(yǎng)箱中，12h后鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計100～150個孢子，并按下式計算萌發(fā)率和抑制率。

1.2.4 核桃青皮提取物對供試菌種菌絲生長活性的測定[15]無菌條件下，取1m L供試液與滅菌的9m L PDA培養(yǎng)基混合后，倒入直徑為9cm培養(yǎng)皿，輕輕搖勻，制成帶毒培養(yǎng)基，各濃度均重復3次；對照加入等量的無菌水，待凝固后，用直徑6mm的打孔器在培養(yǎng)好的供試真菌菌落邊緣切下菌餅反接于培養(yǎng)皿內(nèi)，于28℃培養(yǎng)72h后觀察結(jié)果，用十字交叉法測量菌落擴展直徑，并按下式計算菌絲生長抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用Duncan氏新復極差法對測試結(jié)果進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

通過96h觀察，可知核桃青皮提取物對5種供試菌種的MIC和MBC值（表1），對青霉菌的MIC和MBC值均為5mg/m L；對灰葡萄孢的MIC和MBC值均為10mg/m L；對鐮刀孢和匍枝根霉的MIC、MBC值均為10.0mg/m L和15.0mg/m L；對交鏈孢屬的MIC、MBC值分別為5.0mg/m L和10.0mg/m L。可見，核桃青皮在15.0mg/m L時能有效殺菌。

2.2 核桃青皮乙醇提取物對孢子萌發(fā)的影響

表1 核桃青皮提取物最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定結(jié)果Table1 Minimal inhibitory concentrations and bactericidal concentrations of extracts from walnutgreen husk

核桃青皮提取物對5種供試菌種的孢子均有顯著的抑制作用（表2），不同濃度的提取物對同種菌的抑制率具有明顯的差異（p＜0.05），對鐮刀菌的影響更為明顯，當濃度為1mg/m L和5mg/m L時，對其的抑制率分別為10.24%和43.23%；當濃度為20mg/m L時，完全抑制了其孢子的萌發(fā)。隨著提取物濃度的增加，對其他4種供試菌種的抑制作用也在增強，抑制率均能達到90%以上。通過SPSS分析軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，得核桃青皮提取物對5種供試菌種孢子萌發(fā)抑制率的毒力回歸方程以及EC50（見表3），5種供試菌種的EC50值的次序為青霉菌＜鐮刀菌＜交鏈孢屬＜匍枝根霉＜灰葡萄孢，表明提取物對不同菌種的抑制效果具有差異性，對青霉菌的抑制效果最明顯，對鐮刀菌、匍枝根霉、交鏈孢屬的抑制作用次之，對灰葡萄孢的抑制效果最差，孢子萌發(fā)抑制率和毒力方程結(jié)果基本一致，核桃青皮提取物對供試菌種孢子萌發(fā)的抑制作用見圖1。

圖1 核桃青皮提取物對供試菌種孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.1 Inhibitory effectof EEW on the spore of pathogenic fungi

2.3 核桃青皮乙醇提取物對供試菌種菌絲生長抑制活性的影響

由表4可知，核桃青皮提取物對5種供試菌種菌絲生長均具有很強的抑制作用，不同濃度處理對同種病原菌的抑制效果不同（p＜0.05），且隨濃度的增大抑制作用增強；當提取物濃度為1mg/m L時，對5種供試菌種的抑制率均小于13%，但當濃度為20mg/m L時對大部分供試菌種的抑制率均在90%以上，其中對交鏈孢屬抑制率達91.71%。通過SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，得提取物對5種供試菌種的毒力回歸方程及EC50（見表5），其中EC50值的次序為交鏈孢屬＜青霉菌＜鐮刀＜匍枝根霉＜灰葡萄孢，抑制效果與對孢子萌發(fā)的抑制作用基本趨勢一致，對交鏈孢屬和青霉菌的抑制效果均為明顯。

3 討論

表2 不同濃度核桃青皮提取物對5種供試菌種孢子萌發(fā)的影響Table2 Inhibition effects of extracts from walnutgreen husk by different concentration on spore germination of 5 kinds of pathogenic fungus

表3 核桃青皮提取物對5種供試菌種孢子萌發(fā)抑制作用的毒力方程Table3 Toxicity of extracts from walnut green husk on spore germination against5 kinds of pathogenic fungi

表4 核桃青皮提取物對5種供試菌種菌絲生長的抑制作用Table4 Inhibition effects of extracts from walnutgreen husk by different concentration on hyphal growth of 5 kinds of

核桃青皮中的多酚類、蒽醌類、香豆素類化合物均有較強的抑菌殺菌性[10，16-17]，尤其對多種植物致病真菌有較強的抑制作用。翟繼梅等[13]研究表明，核桃青皮乙醇提取物對水稻紋枯、棉花立枯等植物病原真菌具有較好的抑菌活性。蘇學友等[18]研究表明核桃青皮水提物對蘋果輪紋病菌、蘋果腐爛病菌、小麥赤霉病菌等植物病原真菌抑菌效果明顯。Oliveira等[7]對六種不同品種的核桃青皮提取物的抑菌性進行了對比研究，結(jié)果表明，不同品種的核桃青皮提取物對植物真菌均有顯著的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮提取物對幾種采后病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有較好的抑制作用，對交鏈孢屬和青霉菌的抑制效果更為明顯，與上述核桃青皮提取物對植物真菌抑制作用的報道一致。目前，關于核桃青皮提取物有效抑菌成分的研究相對較少，劉丹萍等[19]通過對核桃青皮中胡桃醌抑菌性的測定，奠定了胡桃醌為核桃青皮主要有效抑菌成分的基礎。但是核桃青皮提取物成分相當復雜，其抑菌性可能為各種酚類物質(zhì)的協(xié)同作用，因此其抑菌機理有待進一步確定。

表5 核桃青皮提取物對5種供試菌種菌絲生長抑制作用的毒力方程Table5 Toxicity of extracts from walnutgreen husk hyphal growth of 5 kinds of pathogenic fungi

以往研究表明，很多植物提取劑對果蔬有一定的防腐保鮮作用，且大部分植物提取物成分之間存在明顯抗菌性的協(xié)同增效作用[20-21]，將提取物進行復配能夠克服或延緩病原菌的抗藥性、擴大殺菌范圍，提高防腐效果[4，22]。因此，對核桃青皮的進一步研究可致力于將其與抗氧化能力強、成膜效果好的物質(zhì)進行復配，根據(jù)不同果蔬的不同儲藏特性，對特定的果蔬進行最優(yōu)配方的選擇。

4 結(jié)論

本實驗中，核桃青皮提取物對5種果蔬采后主要病原真菌均有較好的抑制效果，對孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用趨勢大體一致，表明其在果蔬采后病害防治上有較大的應用潛力。本課題組下一步將致力于其主要抑菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析的研究，從而明確抑菌的物質(zhì)基礎以及在果蔬貯藏過程中的病害防治效果。

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