雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測沙門氏菌

伍燕華，牛瑞江，賴衛(wèi)華，山 珊，劉道峰，倪小琴，馮榮華

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

沙門氏菌是自然界普遍存在的一種食源性致病菌，在中國食物中毒中沙門氏菌引起的病例占第一位[1]，常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾病[2]。

傳統(tǒng)檢測沙門氏菌的方法可分為預(yù)增菌、選擇性增菌及分離鑒定三個(gè)不同階段，全過程至少需要4～7d才能得出檢測結(jié)果[3]。GB 4789.4-2010是目前我國規(guī)定的檢測食品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，主要是根據(jù)沙門氏菌的生化特性進(jìn)行檢測，包括前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型五個(gè)步驟[4]。國標(biāo)法準(zhǔn)確可靠，但檢測時(shí)間太長，因而，建立快速準(zhǔn)確的檢測方法，對于預(yù)防和控制沙門氏菌中毒具有重大意義。

分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢測?？焖贆z測沙門氏菌的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[5-9]、基因芯片[10-11]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[12-13]等。然而，分子生物學(xué)檢測方法要求具有較高素質(zhì)的操作人員、較好條件的檢測儀器以及檢測條件，因此較難在基層大面積推廣使用。

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，容易在基層使用的實(shí)驗(yàn)診斷方法。將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來，可敏感地檢測樣品中微量的特異性抗原。Bang等建立了檢測鼠傷寒沙門氏菌的間接競爭ELISA法[14]，Kumar等采用ELISA法檢測傷寒沙門氏菌[15]，焦新安團(tuán)隊(duì)建立了檢測豬霍亂沙門氏菌感染的單抗競爭ELISA法[16]，朱春紅等采用間接ELISA法檢測腸炎沙門氏菌[17]。然而，沙門氏菌有2600多種血清型，上述的ELISA方法僅僅針對單一類型菌株進(jìn)行檢測。本研究建立了檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法，可以對沙門氏菌A、B、C、D、E等五種典型菌株進(jìn)行篩查，沙門氏菌的檢測范圍大大增加，同時(shí)本文對該方法的靈敏度和特異性進(jìn)行了評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LB肉湯培養(yǎng)基、氯化鎂孔雀綠肉湯選擇性培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗沙門氏菌單克隆抗體C1359 美國Meridian公司；磷酸鹽緩沖液（PBS） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽洗液（PBST） 上海雙螺旋生物科技有限公司。五種沙門氏菌：包括豬霍亂沙門氏菌（ATCC 10708）、甲型副傷寒沙門氏菌（ATCC 9150）、鴨沙門氏菌（ATCC 9150）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）；十五種非沙門氏菌：包括大腸桿菌XY1264、大腸桿菌XY0840、大腸桿菌CMCC44102、大腸桿菌CMCC44496、大腸桿菌CMCC44350、大腸桿菌CMCC44828、阪崎腸桿菌CMCC 45401、阪崎腸桿菌CMCC 45402、志賀氏菌301、志賀氏菌2457、單核增生李斯特菌CMCC54001、單核增生李斯特菌CMCC54007、副溶血弧菌ZDBE、蠟樣芽胞桿菌CMCC49027、枯草芽孢桿菌BD366 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 蘇州安泰；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠；TGL-16臺式離心機(jī) 湖南湘儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫抗原及檢測菌液的制備[18]將保存的鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)接于200m L LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)20h，4000r/min離心10m in收集菌體，0.01mol/L pH7.4的PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌兩次后加入含0.5%福爾馬林的PBS 30m L，室溫下作用24h滅活菌體，然后4000r/m in離心10m in收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸備用。

1.2.2 抗沙門氏菌多克隆抗體的制備 選擇雌性日本大耳兔2只，免疫前耳緣靜脈采血，取陰性血清。隨后進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫。首次免疫抗原量約為1.395×109CFU/只。之后進(jìn)行4次追加免疫，免疫劑量為2.79×109CFU/只，免疫周期為兩周。采用間接ELISA方法測定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到105后，股動脈采血，收集血清，采用辛酸-硫酸銨法純化多抗[19]。

1.2.3 雙抗夾心ELISA方法的建立 將純化后的抗鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體稀釋2500倍，100μL/孔，4℃包被過夜，用PBST（磷酸鹽洗液）洗3次，每孔中加入3%BSA 300μL封閉液，37℃孵育1h。棄去封閉液，用PBST洗3次，每孔230μL。加入沙門氏菌，100uL/孔，并設(shè)置空白對照和陰性對照。用PBST洗4次，每孔230μL。單克隆抗體稀釋200倍，100μL/孔，37℃孵育1h；用PBST洗4次，每孔230μL；加入酶標(biāo)抗體，100μL/孔，37℃孵育0.5h；用PBST洗5次，每孔230μL；加入現(xiàn)配的顯色液四甲基聯(lián)苯胺，100μL/孔，37℃反應(yīng)15m in；加入終止液（2mol/L H2SO4）50μL/孔，終止顯色反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上測定OD450nm值。

1.2.4 細(xì)菌抗原制備 將低溫凍干保存的菌種劃線接種于固體LB平板上，37℃培養(yǎng)18h后挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中（副溶血性弧菌需要高鹽LB培養(yǎng)基），37℃、160r/m in搖床培養(yǎng)18h，將菌液煮沸處理20m in用作檢測抗原。純培養(yǎng)的各種菌株在熱處理前均用無菌0.01mol/m L PBS梯度稀釋后涂布LB平板，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)以確定菌液濃度。

1.2.5 雙抗夾心ELISA檢測五種典型的沙門氏菌 對沙門氏菌的五種菌液（均為5×108CFU/m L）進(jìn)行檢測，其中包括A組的副傷寒沙門氏菌，B組的鼠傷寒沙門氏菌，C組的豬霍亂沙門氏菌，D組的腸炎沙門氏菌和E組的鴨沙門氏菌，結(jié)果以P/N值判定，P/N≥2.1時(shí)判斷為陽性，其計(jì)算公式如下：

1.2.6 ELISA對非沙門氏菌的特異性檢測 對鼠傷寒沙門氏菌和十五種非沙門氏菌的菌液（均為1×108CFU/m L）進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測，確定方法的特異性。

1.2.7 ELISA方法檢測鼠傷寒沙門氏菌的靈敏度 將鼠傷寒沙門氏菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180r/m in振蕩培養(yǎng)12h，平板計(jì)數(shù)后，將系列稀釋后的待檢菌液作為檢測液，加入雙抗夾心ELISA體系中，檢測該方法的靈敏度。

1.2.8 ELISA方法與免疫磁珠富集法結(jié)合在牛奶添加實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用 取25g無菌牛奶加入到225m L無菌水中制成樣品液，將鼠傷寒沙門氏菌5CFU/m L接種量接種于樣品液中，分別取10m L樣品加入到選擇性氯化鎂孔雀綠肉湯培養(yǎng)基中混合均勻，37℃、160r/min條件下培養(yǎng)6～12h，不同時(shí)間取樣，采用免疫磁珠富集分離對樣品進(jìn)行富集分離[20]，得到目的菌后用ELISA檢測，同時(shí)設(shè)置陰性對照及空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種沙門氏菌的ELISA檢測結(jié)果

沙門氏菌有2600多種血清型，主要分為A、B、C、D、E五個(gè)組[21]。P/N值的結(jié)果顯示（表1），雙抗夾心ELISA方法可以檢測到A組的副傷寒沙門氏菌，B組的鼠傷寒沙門氏菌，C組的豬霍亂沙門氏菌，D組的腸炎沙門氏菌和E組的鴨沙門氏菌等五種代表性菌株。

2.2 非沙門氏菌的ELISA檢測結(jié)果

表1 雙抗夾心ELISA檢測五種沙門氏菌的結(jié)果Table1 The resultof five strains of Salmonella by double-antibody sandwich ELISA

用已建立的雙抗夾心ELISA方法對鼠傷寒沙門氏菌和15株非沙門氏菌（表2）進(jìn)行檢測，P/N值的結(jié)果顯示，只有鼠傷寒沙門氏菌顯示陽性，其他15株非沙門氏菌均顯示陰性。

表2 特異性實(shí)驗(yàn)所用菌種Table2 Strains using in specific experiment

表3 雙抗夾心ELISA方法靈敏度檢測結(jié)果Table3 Result of the test of sensitivity by double-antibody sandwich ELISA

2.3 雙抗夾心ELISA方法靈敏度分析

以鼠傷寒沙門氏菌純培養(yǎng)菌液系列稀釋，測定方法的靈敏度，結(jié)果如表3所示，隨著抗原濃度的降低，吸光值下降，P/N值的結(jié)果顯示，該方法對純培養(yǎng)液的檢測限為104CFU/m L。

2.4 牛奶添加實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果

接種量5CFU/m L的牛奶樣品在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間，免疫磁珠法進(jìn)行富集后用雙抗夾心法進(jìn)行檢測，陰性O(shè)D值為0.184，空白OD值為0.085，添加沙門氏菌的牛奶樣品結(jié)果如表4所示，根據(jù)P/N值判斷，培養(yǎng)8h后，通過聯(lián)用免疫磁珠富集和ELISA法，可以檢測出陽性樣本。

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間雙抗夾心ELISA方法檢測結(jié)果Table4 Resultof the double-antibody sandwich ELISA for different culture time

3 結(jié)論

本研究采用福爾馬林滅活的鼠傷寒沙門氏菌全菌抗原免疫日本大白兔，獲得抗沙門氏菌多克隆抗體，以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以單克隆抗體作為檢測抗體，建立了雙抗夾心ELISA方法。該方法可以檢測五株不同類型的沙門氏菌，特異性較強(qiáng)，對鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)液的最低檢測濃度為1.0×104CFU/m L。在牛奶樣品的添加實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)用選擇性增菌液進(jìn)行前增菌，免疫磁珠富集，ELISA方法進(jìn)行檢測，接種量5CFU/m L的樣品在培養(yǎng)8h后可檢出陽性結(jié)果。

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