懸浮固化-分散液-液微萃取-氣相色譜法測(cè)定蔬菜中6種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥

高青珍，馬智玲，周千渝，張延國(guó)，林 桓，劉新燕，李凌云，劉 肅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京100081）

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥自20世紀(jì)70年代被研發(fā)出來(lái)后，因具有殺蟲(chóng)廣譜、高效、生物降解性等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，使用量?jī)H次于有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥[1]。但此類(lèi)農(nóng)藥也有一定蓄積性，長(zhǎng)期接觸會(huì)引起慢性疾病，部分農(nóng)藥還有致癌、致畸、致突變作用，對(duì)哺乳動(dòng)物神經(jīng)、心血管、免疫系統(tǒng)有一定毒性[2]。而且隨著近年來(lái)蔬菜水果中農(nóng)藥殘留問(wèn)題日益凸顯，國(guó)家對(duì)農(nóng)殘方面監(jiān)測(cè)力度加大，因此有必要建立快速、靈敏檢測(cè)蔬菜水果中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的分析方法。

Anastassiades等[3]提出了一種新的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)QuEChERS方法。相較于已有的樣品前處理技術(shù)如固相萃?。⊿PE）、液-液萃?。↙LE）、固相微萃?。⊿PME）、超聲輔助提?。∕AE）等，QuEChERS方法具有快速、簡(jiǎn)單、便宜、安全等特點(diǎn)，已被國(guó)內(nèi)外許多分析機(jī)構(gòu)采用，美國(guó)和歐盟分別建立了適合酸堿敏感農(nóng)藥的官方分析方法AOAC2007.01[4]和EN15662[5]。

分散液-液微萃取技術(shù)（dispersive liquid-liquid m icroextraction，DLLME）具有富集倍數(shù)高，簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，已用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。由于易受到基質(zhì)干擾物的影響，目前該方法只用于簡(jiǎn)單基質(zhì)如水樣[6]和果汁[7]等簡(jiǎn)單基質(zhì)的農(nóng)藥殘留的提取富集。

Huang和Feng等[8]提出一種新型DLLME微萃取技術(shù)，懸浮固化-分散液液微萃?。╠ispersive liquidliquid m icroextraction-Solidification of floating organic drop，DLLME-SFO），萃取劑為不含氯元素的長(zhǎng)鏈脂肪烴或脂肪醇（如十一醇、十二醇、十六烷等）避免了常用高毒含氯溶劑（氯苯、氯仿和四氯化碳等）危害環(huán)境和人體健康，而且當(dāng)檢測(cè)器為氣相色譜（ECD），最終濃縮溶液無(wú)需進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。

因菊酯類(lèi)農(nóng)藥在氣相色譜（ECD）上響應(yīng)值比較低，本文旨在將QuEChERS和DLLME-SFO方法結(jié)合起來(lái)，以達(dá)到快速凈化和有效濃縮的目的。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，滿(mǎn)足對(duì)幾種蔬菜基質(zhì)中6種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯氟氰菊酯CAS 68359-37-5、氯菊酯CAS 52645-53-1、氟氰戊菊酯CAS 70124-77-5、氰戊菊酯CAS 51630-58-1、氟胺氰菊酯CAS 102851-06-9、溴氰菊酯CAS 52918-63-5 Dr1EhrenstorferGmbH和Sigma公司；乙腈、丙酮 色譜純；冰醋酸、無(wú)水醋酸、氯化鈉 分析純；無(wú)水硫酸鎂 分析純，用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5h，冷卻后取出放入干燥器備用；十六烷色譜純GC，純度＞99.0%；PSA粉、ODS C18粉、石墨炭黑粉 購(gòu)于Agela Technologies公司。

RTX-1MS型毛細(xì)管柱 美國(guó)安捷倫公司；GC-2010型氣相色譜 島津公司；高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；IKAT18型均質(zhì)器 德國(guó)IKA公司；WH-2微型漩渦混合儀 上海瀘西分析儀廠有限公司；AB204/01型分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：RTX-1MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.5μm）；載氣：氮?dú)猓兌?9.999%）；電子捕獲檢測(cè)器溫度：320℃；恒壓模式，壓力：94.4kPa；尾吹氣流量：50m L/m in；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；1m in后打開(kāi)分流閥和隔墊吹掃閥；隔墊吹掃流量：3m L/m in；柱溫箱升溫程序：初始溫度150℃（保持1m in），以10℃/m in升溫至180℃，再以3℃/m in升溫至220℃（保持10m in）；再以5℃/m in升溫至290℃（保持12m in）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將1000mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋?zhuān)渲瞥筛鬓r(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為10.00mg/L的混合工作溶液，于-18℃冰箱中保存待用（兩周后需重新配制）。使用時(shí)稀釋至一定濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

1.3 樣品前處理

精確稱(chēng)取勻漿后的蔬菜樣品10.00g（精確至0.01g）于50m L聚四氟乙烯離心管中，加入1g NaCl及10.0m L 1%乙酸乙腈溶液，均質(zhì)1m in，靜置，待乙腈層與水層分離后加入3g MgSO4和1g醋酸鈉，振蕩混勻。以5000r/min高速離心5min，取2.00m L上清液轉(zhuǎn)入裝有100mg PSA、100mg C18的5m L離心管中，渦旋振蕩1m in后取上清液1.00m L于含5m L NaCl（加入量為1.25g）溶液的15m L具塞的尖底離心試管中，再加入40μL十六烷，渦旋混勻1min。后于5000r/min下離心3min使之分層；將離心試管置于冰浴中浸泡5m in，此時(shí)十六烷凝固呈環(huán)狀凝固壁上，除去下層水層，待萃取劑溶解后，5000r/min高速離心2min，此時(shí)殘余的水即可和萃取劑分開(kāi)，吸取上層萃取劑，供GC-ECD分析。

1.4 樣品分析

樣品分析時(shí)，在相同色譜條件下，測(cè)定五個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品，目標(biāo)物以保留時(shí)間定性，用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS方法條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 在農(nóng)藥殘留樣品前處理過(guò)程中，常用的提取劑有乙腈、乙酸乙酯和丙酮等。由于丙酮提取液中色素含量比較多，乙酸乙酯易提取蠟質(zhì)、脂肪等非極性干擾物，且大部分極性農(nóng)藥不易轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取劑。由于一些農(nóng)藥容易受基質(zhì)pH的影響，本文比較了乙腈和1%的乙酸乙腈作為萃取劑時(shí)的差異。由圖1可知，1%的乙酸乙腈提取效果較好，因此選擇1%乙酸乙腈作為提取劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)提取效果的影響Fig.1 Infulunce of the differentextraction solventon the extraction efficiency

2.1.2 萃取劑的選擇 在懸浮固相液-液萃取中，萃取劑需滿(mǎn)足的條件為在水中的溶解度低，對(duì)待測(cè)目標(biāo)物有較強(qiáng)的提取能力。本實(shí)驗(yàn)比較了十一醇、十二醇、十六烷這三種萃取劑的差異，從圖2中可以看出十六烷對(duì)大部分農(nóng)藥的提取效率最高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇十六烷作為萃取劑。

圖2 不同萃取劑對(duì)提取效果的影響Fig.2 Infulunce of the differentextraction solventon the extraction efficiency

2.1.3 萃取劑體積的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了萃取劑十六烷在30、40、50、60、70μL時(shí)對(duì)萃取效果的影響。當(dāng)十六烷體積為40μL時(shí)，可以看出農(nóng)藥的回收率最大。因?yàn)殡S著萃取劑體積的增大，萃取相中的待測(cè)物濃度減小，而萃取相中待測(cè)物總量等于體積乘以濃度，在二者相互關(guān)系下，在某一值時(shí)，回收率達(dá)到了最大值。故選擇萃取劑體積為40μL。

圖3 萃取劑體積對(duì)提取效果的影響Fig.3 Influnce of extraction solvent volume on the extraction efficiency

圖4 分散劑體積對(duì)提取效果的影響Fig.4 Infulunce of dispersive solvent volume on the extraction efficiency

2.1.4 分散劑體積的的選擇 分散劑的體積能影響乳濁液的形成和萃取效率的大小，當(dāng)分散劑體積小時(shí)，對(duì)萃取劑分散效果不好，影響乳濁液的形成；當(dāng)分散劑用量較大時(shí)，待測(cè)物在水中的溶解度增大，萃取效率降低。本實(shí)驗(yàn)考察了分散劑體積為0.5、0.75、1、1.25、1.5m L時(shí)對(duì)萃取效果的影響。從圖4中可以看出，當(dāng)乙腈體積大于1m L時(shí)，萃取效率逐次降低。為了提高萃取相中待測(cè)物的濃度，提高檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇1m L作為分散劑的體積。

2.1.5 離子強(qiáng)度的影響 在萃取過(guò)程中，鹽濃度會(huì)影響目標(biāo)物在水中的溶解度，從而影響萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了在5m L水中，氯化鈉加入量為0～1.5g時(shí)，離子效應(yīng)的作用。從圖5中可以看出，農(nóng)藥在氯化鈉的加入量為1.25g時(shí)，萃取效果最好，因?yàn)殡S著水中離子強(qiáng)度增加，待測(cè)物在水中的溶解度降低，有利于待測(cè)物進(jìn)入有機(jī)相；而當(dāng)鹽的量為1.5g時(shí)（基本鹽達(dá)到飽和），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)待測(cè)物峰面積很低，可能是此鹽濃度下阻礙了分散體系的形成，因此本實(shí)驗(yàn)選擇鹽的用量為1.25g。

圖5 NaCl的濃度對(duì)提取效果的影響Fig.5 Influnce of NaCl concentration on the extraction efficiency

2.2 方法學(xué)確證

2.2.1 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限 在已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，將10g空白蔬菜樣品黃瓜、番茄中添加混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為2.5、5、7.5、10、25、50、75、100μg/kg，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行萃取、凈化、濃縮，以峰面積Y對(duì)濃度X（μg/kg）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。富集25倍，六種擬除蟲(chóng)菊酯在2.5～100μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，其線性相關(guān)系數(shù)R均大于0.996。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），從表1中可以看出七種菊酯類(lèi)農(nóng)藥的檢出限和定量限分別在0.07～0.58μg/kg和0.22～1.94μg/kg之間，該方法靈敏度高，滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留痕量檢測(cè)的要求。

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 分別在上述兩種空白基質(zhì)中添加混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度分別為5、10、50μg/kg，每個(gè)濃度水平設(shè)定6個(gè)重復(fù)樣品，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），6種菊酯類(lèi)農(nóng)藥3個(gè)添加水平下的平均回收率為84.84%～111.59%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.48%～9.61%，表明該實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-DLLME-SFO-GC聯(lián)用測(cè)定蔬菜中6種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)方法。樣品用QuEChERS方法提取、凈化，提取液再經(jīng)DLLMESFO濃縮，樣品前處理方法簡(jiǎn)單，快速，濃縮倍數(shù)高，提高了六種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的靈敏度，可以作為蔬菜基質(zhì)中擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的檢測(cè)方法。

表1 6種菊酯類(lèi)農(nóng)藥的檢出限、定量限及其在黃瓜、番茄基質(zhì)中的平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）Table1 Limits of detection（LOD），the limitof quantification（LOQ），and the average recoveries，standard deviations（RSDs）of the

[1]孫成玲，汪付星，顏冬云，等.擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2010，49（1）：11-15.

[2]H M Mohnssen.Chronic sequelae and irreversible injuries following acute pyrethroid intoxication[J].Toxicology Letters，107（1-3）：161-176.

[3]M Anastassiades.Fastand easymultiresiduemethod employing acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solid-phase extraction”for the determination of pesticide residues in produce [J].AOAC Int，2003，86（2）：412-432.

[4]S J Lehotay.Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile Extraction and partitioning with magnesium sulfate：collabarative study[J].AOAC Int，2007，90（2）：485.

[5]SJLehotay，KA Son，H Kwon，etal.Comparison ofQuEChERS sample preparationmethods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables[J].Chromatography A，2010，1217（4）：2548-2560.

[6]Gao ZB，Ma XG.Speciation analysis of mercury in water samples using dispersive liquid-liquid microextraction combined with high-performance liquid chromatography[J].Analytica Chimica Acta，2011，702（1）：50-55.

[7]S C Cunha.Fast analysis of multiple pesticide residues in apple juice using dispersive liquid-liquid microextraction and multidimensional gas chromatography-mass spectrometry[J].Chromatography A，2009，1216（51）：8835-8844.

[8]IM Leong，Huang SD.Dispersive liquid-liquidmicroextraction method based on solidification of floating organic drop combined with gas chromatography with electron-capture or mass spectrometry detection[J].Chromatography A，2008，1211（2）：8-12.