響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取安吉白茶抗氧化物質(zhì)工藝

呂娜，龍壽芬，夏海洋，趙麗丹，沈明浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取安吉白茶抗氧化物質(zhì)工藝

呂娜，龍壽芬，夏海洋，趙麗丹，沈明浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

采用超聲波法對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間對(duì)提取液抗氧化性的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，依據(jù)回歸分析確定最優(yōu)提取條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%，提取時(shí)間為51min，超聲功率為480W。此時(shí)提取液抗氧化性最強(qiáng)，OD700nm為0.881。

響應(yīng)面法；安吉白茶；抗氧化；提取工藝

在食品及油脂的抗氧化和保鮮中，人們長(zhǎng)期以來(lái)一直使用人工合成抗氧化劑，但試驗(yàn)證明人工合成抗氧化劑有較多的副作用，過(guò)量添加會(huì)損害人體健康[1-2]。因此，近幾年國(guó)際食品工業(yè)更傾向于研究和開(kāi)發(fā)安全無(wú)毒和天然的食品抗氧化劑[3]。在天然抗氧化劑中，以茶葉抗氧化性的研究最多，因其食用廣泛也受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。安吉白茶是一種自然突變綠茶，因清明前嫩葉呈白色而得名，是我國(guó)的珍稀茶種[4-6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)我國(guó)安吉白茶的保健功能較為關(guān)注，其營(yíng)養(yǎng)學(xué)成分分析結(jié)果表明，安吉白茶中氨基酸、茶多酚、茶氨酸、咖啡因、硒等物質(zhì)含量都優(yōu)于其他一般性茶類(lèi)[7-8]，因此，專(zhuān)家推斷安吉白茶對(duì)人體生理健康等方面所起的有益作用會(huì)更加明顯，在食品及保健品市場(chǎng)具有廣闊前景[9-10]。安吉白茶中富含大量具有抗氧化功能的物質(zhì)。超聲波提取技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展的一種方法，具有快速、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種植物成分的提取[11]。本試驗(yàn)研究了超聲波提取安吉白茶中抗氧化物質(zhì)的工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)主要工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而為更好的利用我國(guó)安吉白茶資源提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：安吉白茶購(gòu)于杭州佐佑茶葉有限公司

試劑：無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、FeC13、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9140A型干燥箱：南京恒裕電子儀器廠；DELTA320型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；sp-722E可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 安吉白茶提取物的制備

安吉白茶烘干后粉碎。稱(chēng)取1g粉末，根據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定每組的提取條件，加入10mL一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行提取，設(shè)置提取時(shí)間和超聲功率。將得到的提取液離心后取上清，靜置，真空濃縮除乙醇，定容至10 mL。

1.3.2 提取液抗氧化性的測(cè)定

物質(zhì)的還原能力可以看作其潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)，因此本研究采用鐵氰化鉀法來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化能力。分別取0.6mL安吉白茶提取液，加入0.2mol/L（pH=6.6）磷酸緩沖溶液0.6mL及1%鐵氰化鉀0.6mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入10%三氯乙酸（TCA）溶液0.6mL終止反應(yīng)，3 000r/min離心10min，取2mL上清液，依次加入4mL蒸餾水及1mL0.1%FeCl3，混勻后于波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度值。OD700nm值越大，還原力越大。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以O(shè)D700nm為衡量指標(biāo)，分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和超聲功率3個(gè)因素的對(duì)安吉白茶抗氧化活性物質(zhì)提取的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)因素水平，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以O(shè)D700nm為響應(yīng)值，采用Design Expert.8.05b軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案[12]，確定最佳提取條件的因素和水平，建立數(shù)學(xué)回歸模型，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)化分析，因素水平見(jiàn)表1。

表1Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響

設(shè)定超聲功率為400W，提取時(shí)間30min，研究不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～50%時(shí)，提取液OD700nm值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞50%時(shí)，OD700nm值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減小。這可能是由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至一定值時(shí)，提取溶劑與抗氧化活性物質(zhì)極性差別增大，同時(shí)安吉白茶中一些醇溶性、親脂性強(qiáng)的成分溶解量增大，與抗氧化活性物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)同乙醇-水分子結(jié)合，減小了活性物質(zhì)的溶解。因此，選取提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%左右為宜。

2.1.2 超聲功率對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響

設(shè)定超聲時(shí)間30min，提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，研究在不同提取功率時(shí)所獲提取液的抗氧化性，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在超聲功率為500W條件下，提取液OD700nm值達(dá)到最大，即提取液的抗氧化活性達(dá)到最高值，而繼續(xù)增加超聲波功率，OD700nm值變化不明顯且略有降低。這可能是由于過(guò)強(qiáng)的超聲波功率導(dǎo)致安吉白茶中抗氧化活性物質(zhì)的破壞；同時(shí)，較高功率條件下的超聲波可能導(dǎo)致一部分極性較強(qiáng)的抗氧化活性物質(zhì)發(fā)生高頻運(yùn)動(dòng)而熱降解[13]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on antioxidant activity of Anji white tea extract

圖2 提取功率對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響Fig.2 Effect of extraction power on antioxidant activity of Anji white tea extract

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)提取效果的影響

設(shè)定提取功率為400W，提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇，研究不同提取時(shí)間對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為30～50min時(shí)，OD700nm值隨提取時(shí)間的增加而增加，表明超聲波能快速促進(jìn)植物細(xì)胞破壁，加速提取溶劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)的滲透。50min時(shí)OD700nm值達(dá)到最大，之后隨提取時(shí)間增加OD700nm值減小，這可能與安吉白茶較長(zhǎng)時(shí)間暴露于超聲波條件下，提取物中部分具有抗氧化活性的成分發(fā)生了分解有關(guān)。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化安吉白茶抗氧化物質(zhì)的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)因素水平，運(yùn)用Design Expert.8.05b軟件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14-15]，以表1的因素水平設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，試驗(yàn)分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 提取時(shí)間對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性的影響Fig.3 Effect of extraction time on antioxidant activity of Anji white tea extract

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert.8.05b軟件，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得OD700nm（Y）對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=0.87+0.027A+ 0.026B-0.035C-0.037AB+0.022AC+8.750E-003BC-0.074A2-0.081B2-0.045C2

由表3可知，回歸方程模型的P值＜0.01，說(shuō)明用該回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量與全體自變量之間的關(guān)系是極其顯著的，說(shuō)明了該方法是可靠的。失擬項(xiàng)P=0.141 3＞0.05，差異不顯著，表明無(wú)失擬因素存在，因此可以用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。相關(guān)系數(shù)R2= 0.902 6，說(shuō)明該模型能解釋90.26%的響應(yīng)面變化，即該模型擬合優(yōu)度較好。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為4.9%，說(shuō)明其置信度較高，模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，可用此模型分析響應(yīng)值的變化。綜合以上分析可以說(shuō)明該模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)安吉白茶抗氧化物質(zhì)的最佳提取條件。由回歸方程及表3可見(jiàn)，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是成簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，因素A2、B2的影響差異極顯著，C、C2的影響差異顯著，表明以上因素對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)的提取影響較大。由3因素的P值可見(jiàn)，各因素對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)提取的影響大小順序?yàn)槌暪β剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

2因素交互作用的響應(yīng)曲面及其等高線(xiàn)見(jiàn)圖4。表示了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率及提取時(shí)間3個(gè)因素中任意一個(gè)變量為零水平時(shí)，其余2個(gè)變量對(duì)安吉白茶抗氧化物質(zhì)提取的影響。在響應(yīng)面分析中，響應(yīng)曲面的陡峭程度反映了響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件改變的敏感程度。由乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取功率的交互作用圖可見(jiàn)，提取功率的曲面較陡，乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面較平緩，說(shuō)明提取功率對(duì)抗氧化物質(zhì)提取的影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響不顯著。同樣，超聲功率相對(duì)于提取時(shí)間的影響更顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)于提取時(shí)間的影響更顯著。

2.2.4 安吉白茶抗氧化物質(zhì)提取工藝條件的確定

利用Design-Expert軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化分析，結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，得出超聲波提取安吉白茶抗氧化物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為體積分?jǐn)?shù)為51%乙醇溶液、超聲功率480W、提取時(shí)間51min，在此條件下預(yù)測(cè)的OD700nm為0.877。在此最佳條件下進(jìn)行的3次重復(fù)試驗(yàn)的OD700nm為0.881，與響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果差異不顯著，置信區(qū)間（confidenceinterval，CI）＜95%，表明該模型具有一定的可靠性。以15mg/LVC為對(duì)照，在本試驗(yàn)條件下OD700nm為0.855。

圖4 各兩因素交互作用對(duì)安吉白茶提取液抗氧化性影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surfaces and contour plot of interaction among each two factors of ethanol concentration,ultrasonic power and extraction time on antioxidant activity of Anji white tea extract

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上將響應(yīng)面法應(yīng)用到安吉白茶抗氧化物質(zhì)的提取，最終獲得安吉白茶抗氧化物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，超聲功率480W，提取時(shí)間51min。在此條件下，OD700nm為0.881，與模型預(yù)測(cè)值（0.877）接近。本研究將為今后安吉白茶的綜合利用以及天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

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Optimization of ultrasonic extraction of antioxidant substances from Anji white tea by response surface methodology

Lü Na,LONG Shoufen,XIA Haiyang,ZHAO Lidan,SHEN Minghao
（College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China）

Ultrasonic wave was applied for extraction of antioxidant substances from Anji white tea.Effects of ethanol concentration,ultrasonic power and extraction time on the extract antioxidant activity were investigated.On the basis of single factor investigation,response surface methodology with three factors at three levels was adopted to optimize the extraction technology of antioxidant substances from Anji white tea.The optimum extraction parameters were determined by the regression analysis.Results showed that the optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration 51%vol,extraction time 51 min,and ultrasonic power 480 W.Under the optimized condition,the extract showed the highest antioxidant activity with theOD700nmvalue of 0.881.

response surface methodology;Anji white tea;antioxidant activity;extraction technology

TS201.1

A

0254-5071（2014）03-0087-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.021

2014-01-10

浙江省科技廳公益項(xiàng)目（2010C32066）；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金（201308）

呂娜（1980-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。