響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻LS1057產(chǎn)二十二碳六烯酸發(fā)酵條件

孫中貫，劉詠，姚建銘

(1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；3.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所，安徽 合肥 230031)

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，簡(jiǎn)稱DHA），有腦黃金之稱，是一種對(duì)人體非常重要的多不飽和脂肪酸，屬于Omega-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員。而動(dòng)物和人體不能自身合成二十二碳六烯酸，必須從外界攝入[1]。二十二碳六烯酸具有健腦、提高記憶力和視力的作用，尤其它可以促進(jìn)胎兒腦細(xì)胞發(fā)育和嬰幼兒腦細(xì)胞生長，防治老年性癡呆及動(dòng)脈粥樣硬化、腦血栓等心腦血管疾病，受到食品界和醫(yī)療界的廣泛關(guān)注[2]。二十二碳六烯酸傳統(tǒng)的來源是從魚油中獲取，但由于受到原料、生產(chǎn)周期等諸多限制因素的影響，很難滿足生產(chǎn)消費(fèi)的需求。利用隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸具有發(fā)酵周期短、培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)生的油脂中幾乎不含影響嬰幼兒生長發(fā)育的二十碳五烯酸(EPA)，已被批準(zhǔn)添加到嬰幼兒的食品和營養(yǎng)品中[3-4]。但因藻種二十二碳六烯酸產(chǎn)量較低，滿足不了工業(yè)化生產(chǎn)的要求，使其應(yīng)用受到限制。二十二碳六烯酸的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過程, 為了提高其產(chǎn)量可以從多方面入手, 尋找適合藻株生長代謝的營養(yǎng)源以及發(fā)酵方式是一條可行的途徑。

已報(bào)道的有關(guān)隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸培養(yǎng)基的研究，都是對(duì)單一營養(yǎng)源[5-9]或多種營養(yǎng)源進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)[10]，尚未有應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基中各營養(yǎng)組分進(jìn)行綜合考察和研究的報(bào)道。筆者在前期工作中誘變得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的隱甲藻藻株LS1057，本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，從優(yōu)化營養(yǎng)源入手，利用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件綜合考察和評(píng)價(jià)了隱甲藻LS1057發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的各組分，對(duì)主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化；并對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了中試發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隱甲藻(Crypthecodinium cohnii) LS1057，由本實(shí)驗(yàn)室采用亞硝基胍誘變得到[11]；菌種活化培養(yǎng)基 葡萄糖5.0g/L，酵母膏1.0g/L，海鹽 20.0g/L，蒸餾水配制；種子培養(yǎng)基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海鹽16.0g/L，蒸餾水配制；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖30.0g/L，酵母膏6.0g/L，海鹽16.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L，KH2PO40.1g/L，KNO35.0g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g/L，M液1%(V/V)，采用蒸餾水定容，調(diào)整pH為7.0；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L；擴(kuò)大培養(yǎng)基 葡萄糖8.0g/L，酵母膏2.5g/L，海鹽 20.0g/L，蒸餾水配制；種子罐培養(yǎng)基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海鹽20.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液1%(V/V)，采用自來水定容，調(diào)整pH為6.5；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L。發(fā)酵罐培養(yǎng)基 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，葡萄糖濃度改為優(yōu)化后濃度的一半，其余培養(yǎng)基成分不變。二十二碳六烯酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國SIGMA公司，純度≥99%；泡敵(甘油聚氧丙烯醚) 非離子型，江蘇省海安石油化工廠；維生素 B1、維生素 B12 生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海鹽 德國AB速溶生態(tài)鹽；其他試劑 均為分析純。DL-5-B型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6030B真空干燥箱 東莞市豪邦工業(yè)設(shè)備有限公司；XFH-75CA型電熱式壓力蒸汽滅菌器 深圳市鼎鑫宜實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GC-14C氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)和N2000色譜工作站）日本島津公司；GUJS-70L型機(jī)械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法 菌種活化：種子液為低溫黑暗條件下甘油管保存的種液，250m L三角瓶，裝液量20%(V/V)，接種量2%(V/V)，25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)72h。液體種子培養(yǎng)：種子液為菌種活化培養(yǎng)液，250mL三角瓶，裝液量20%(V/V)，接種量2%(V/V)，25℃、100r/min振蕩培養(yǎng) 72h；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：種子液為搖瓶液體種子培養(yǎng)液，500m L三角瓶，裝液量10%(V/V)、接種量10%(V/V)，26℃、150r/m條件下振蕩培養(yǎng) 216h。搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)：種子液為菌種活化培養(yǎng)液，1000m L三角瓶，裝液量30%(V/V)，接種量10%(V/V)，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)72h。

1.2.2 生物量的測(cè)定 50m L樣液裝入預(yù)先稱重的離心管中，4000r/min離心5min，沉淀用蒸餾水洗滌3次，50℃真空干燥，在干燥器內(nèi)冷卻后稱重，直至恒重。

式中：W-細(xì)胞干燥后的重量/g；V-所量取的發(fā)酵液體積/m L。

1.2.3 油脂含量的測(cè)定 采用 Soxhlet法[12]提取菌體中的總油脂。稱取一定量的干菌體加入適量的石英砂于研缽中進(jìn)行研磨，研磨至菌體成粉末狀用濾紙包好后，50℃真空干燥至恒重，稱重后進(jìn)行提取。提取試劑：正己烷，虹吸速率：8～12次/h。水浴溫度：85℃，提取時(shí)間12h。分別稱量提取前后紙包的重量。

式中：W1-提取前紙包重/g；W2-提取后紙包重/g；W0-干菌體重/g。

1.2.4 二十二碳六烯酸含量的測(cè)定

1.2.4.1 油脂的甲酯化 取50mg油脂，置于100mL的磨口燒瓶中，加入0.5mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液2m L，于60℃水浴30min進(jìn)行皂化，冷卻后加入2m L三氟化硼-乙醚（體積比為1:1）溶液，60℃水浴10min，冷卻后加入5m L正己烷振蕩，然后加入5m L飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相，抽取上層可直接進(jìn)樣。

1.2.4.2 脂肪酸檢測(cè) 氣相色譜法，色譜條件為：FID 檢測(cè)器，毛細(xì)管色譜柱DB-23(30m×0.32mm)，載氣為純度為99.99%的氮?dú)猓至鞅?1:70。進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣量1μL。采用程序升溫，140℃保持3min，10℃/min升溫，升溫至250℃，保持15min，每個(gè)樣29min，為保持?jǐn)?shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次，取平均值。在同一色譜條件下，用已知的二十二碳六烯酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間與樣品脂肪酸甲酯組分色譜峰的保留時(shí)間對(duì)照進(jìn)行分析。

1.2.5 發(fā)酵液中還原糖的檢測(cè) 采用DNS法[13]對(duì)發(fā)酵液中的還原糖含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 響應(yīng)面法(Response Surface Analysis, RSA)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn) 從發(fā)酵培養(yǎng)基各種成分中篩選出對(duì)二十二碳六烯酸產(chǎn)量影響比較顯著的因素。利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行各個(gè)因素的顯著性分析；采用多元線性回歸模型中的逐步回歸法[14]擬合顯著因素與產(chǎn)量之間的線性方程。擬合的方程為：Y=β0+β1X1+β2X2+…+βnXn，式中Y為二十二碳六烯酸的產(chǎn)量(g/L)，X1、X2…Xn為顯著因素，β0為截距，β1、β2…βn為線性系數(shù)，n為顯著因素的個(gè)數(shù)[15]。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的8種成分進(jìn)行考察，每個(gè)因素選高(+1)和低(-1)2個(gè)水平，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，Plackett-Burman試驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平范圍Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的因素作顯著性分析，找出顯著因素。根據(jù)擬合函數(shù)回歸系數(shù)的符號(hào)和大小來設(shè)計(jì)顯著因素的最陡上升路徑，其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值[16]。試驗(yàn)組數(shù)由經(jīng)驗(yàn)來定，步長由顯著因素的效應(yīng)值確定。通過使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.3 Box-Behnken法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)共需15次實(shí)驗(yàn)。擬合出的一個(gè)二次多項(xiàng)式方程是描述響應(yīng)變量與自變量的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)于三因素系統(tǒng)，模型可表述為：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X+β12X1X2+β13X1X3+β22X+β23X2X3+β33X，式中X1、X2、X3為對(duì)響應(yīng)值影響顯著的3種培養(yǎng)基組分的質(zhì)量濃度，Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，即二十二碳六烯酸的產(chǎn)量(g/L)，β0為常數(shù)項(xiàng)，β1、β2、β3為線性系數(shù)，β11、β22、β33為平方系數(shù)，β12、β13、β23為交互作用系數(shù)[17]。綜合最陡爬波試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù) Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表2。用SAS(Version 9.2)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析，用t檢驗(yàn)驗(yàn)證回歸系數(shù)的顯著性，用F檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型方程的顯著性，方程的擬合性由確定系數(shù)R2確定。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table2 Factors and level value of response surface analysis

1.4 模型驗(yàn)證 用SAS(Version 9.2)對(duì)多元函數(shù)進(jìn)行擬合和方差分析。對(duì)Y進(jìn)行嶺嵴分析，可確定出其極值點(diǎn)[18]。再按照計(jì)算所得到的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹貜?fù)性和可靠性，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。

1.5 中試發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 發(fā)酵試驗(yàn)方法

1.5.1.1 種子罐培養(yǎng) 種子液為搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)液，發(fā)酵罐體積30L，培養(yǎng)體積15L。121℃滅菌25min，滅菌前加入5m L泡敵。接種量10%(V/V)，罐溫28℃，罐壓0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，通氣量30L/min，pH6.5用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%檸檬酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，培養(yǎng)時(shí)間72h。

1.5.1.2 發(fā)酵條件 發(fā)酵罐體積 70L，裝液量 40L。121℃滅菌 25min，滅菌前加入 10mL泡敵。接種量5L，培養(yǎng)體積45L，罐溫30℃，96h后調(diào)至25℃，罐壓0.1MPa，攪拌轉(zhuǎn)速150～300r/min，通氣量50～90L/min，pH6.5用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%檸檬酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量根據(jù)溶氧量進(jìn)行調(diào)節(jié)，從接種后開始，每隔 12h取樣，直至發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)時(shí)間為216h。

1.5.2 分批補(bǔ)料發(fā)酵策略 在搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)。根據(jù)發(fā)酵液中剩余葡萄糖的濃度，確定葡萄糖的補(bǔ)加時(shí)間。發(fā)酵開始時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%，在發(fā)酵過程中當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近0.5%時(shí)，以補(bǔ)料的最大速度進(jìn)行葡萄糖的添加，添加量為發(fā)酵液體積的2%(V/V)。以此種方式進(jìn)行葡萄糖的添加，葡萄糖的最終使用量不超過80g/L(以發(fā)酵體積計(jì))。補(bǔ)加的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響二十二碳六烯酸搖瓶發(fā)酵的顯著因素的篩選

選用n=12的設(shè)計(jì)方案，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的8種成分進(jìn)行考察，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。運(yùn)用SAS9.2軟件對(duì)各因素效應(yīng)進(jìn)行t檢驗(yàn)，選擇影響二十二碳六烯酸搖瓶發(fā)酵的顯著性因素，各因素的效應(yīng)分析結(jié)果見表4。從表4中可以看出，培養(yǎng)基成分及接種量對(duì)二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響顯著性的排序?yàn)椋浩咸烟?酵母膏>KH2PO4>KNO3>MgSO4·7H2O>海鹽>M液>FeSO4·7H2O。其中，對(duì)二十二碳六烯酸產(chǎn)量有顯著(p<0.05)影響的因素為X1（葡萄糖）、X2（酵母膏）、X5(KH2PO4)，利用多元線性回歸模 型 中 的 逐 步 回 歸 法 擬 合 (p<0.05)得 到 的 線 性 方 程 為：Y=1.200667+0.092833X1+0.057333X2+0.048333X5，方程的決定系數(shù) R2=0.9649，表明該回歸方程擬合良好。從方程可以看出三個(gè)顯著因素均具有正效應(yīng)，故應(yīng)適當(dāng)增加這三者的質(zhì)量濃度，做進(jìn)一步的考察。X3（海鹽）、X4(MgSO4·7H2O)、X6(KNO3)、X7(FeSO4·7H2O)、X8（M液）對(duì)二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響并不顯著，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的效應(yīng)值符號(hào)，各非顯著因素的取值分別為：海鹽20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L、M液1%(V/V)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表Table3 Plackett-Burman test design and results (cellulaes activity)

3-1 1 1-1 1-1-1-1 1.229 4 1-1 1 1-1 1-1-1 1.243 5 1 1-1 1 1-1 1-1 1.372 6 1 1 1-1 1 1-1 1 1.489 7-1 1 1 1-1 1 1-1 1.126 8-1-1 1 1 1-1 1 1 1.041 9-1-1-1 1 1 1-1 1 1.080 10 1-1-1-1 1 1 1-1 1.283 11-1 1-1-1-1 1 1 1 1.146 12-1-1-1-1-1-1-1-1 1.025

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及其效應(yīng)評(píng)價(jià)Table4 Levels and effects of eight factors after Plackett-Burman design optim ization

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，因此應(yīng)先使得顯著因素的水平盡量逼近二十二碳六烯酸的最大產(chǎn)量區(qū)域再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗(yàn)可以滿足這一要求。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出的顯著因子的效應(yīng)大小設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，尋找二十二碳六烯酸的最大產(chǎn)量區(qū)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。二十二碳六烯酸的最大產(chǎn)量區(qū)在第4次實(shí)驗(yàn)附近，以實(shí)驗(yàn)4的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

產(chǎn)量(g/L) 1 40 8 0.2 1.208 2 50 10 0.3 1.437 3 60 12 0.4 1.585 4 70 14 0.5 1.682 5 80 16 0.6 1.467 6 90 18 0.8 1.329

2.3 Box-Behnken法確定顯著因素的最優(yōu)水平

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定顯著因素的最優(yōu)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為兩類：一類是析因點(diǎn)，共12個(gè)；一類是零點(diǎn)(試驗(yàn)點(diǎn)13，14，15)為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)重復(fù)3次，用于估計(jì)試驗(yàn)的誤差。

表6 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table6 Response surface Box-Behnken design and corresponding response

根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以二十二碳六烯酸產(chǎn)量Y值為效應(yīng)值，由SAS9.2軟件擬合得到的回歸方程模型為：Y=1.779667+0.217875X1+0.036625X2-0.02625X5-0.222958X-0.08475X1X2+0.034X1X5-0.148458X-0.0915X2X5-0.133708X?；貧w模型方差分析見表7，系數(shù)估計(jì)見表8。

表7 回歸模型的方差分析Table7 Analysis of variance (ANOVA )of quadratic polynom ial model

模型 9 0.753316 0.083702 139.53 <0.0001誤差項(xiàng) 5 0.002999 0.0006擬合項(xiàng) 3 0.002927 0.000976 26.85092 0.0361純誤差項(xiàng) 2 0.000073 0.000036合計(jì) 14 0.756315

表8 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table8 Significance test of regression coefficient

方程自變量平方項(xiàng)的符號(hào)皆為負(fù)值，即拋物線的開口向下，因此存在對(duì)應(yīng)的極大值點(diǎn)。由方差分析可知，大于F值的概率為小于0.0001，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性極好，不同處理間的差異非常顯著；而且模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9889，表明了相應(yīng)模型可以解釋 98.89%的總體變異情況，只有 1.11%的變異無法用模型來解釋，回歸模型有高度的相關(guān)性[19-20]?？梢杂眠@個(gè)模型對(duì)二十二碳六烯酸的產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。聯(lián)合響應(yīng)面回歸分析和回歸方程繪制的響應(yīng)面圖形如下（圖1～圖4）：

圖1 葡萄糖與酵母膏交互影響二十二碳六烯酸產(chǎn)量的預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of glucose and yeast extract on the yield of DHA

圖2 葡萄糖與KH2PO4交互影響二十二碳六烯酸產(chǎn)量的預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot for the interaction effects of glucose and KH 2PO4 on the yield of DHA

圖3 酵母膏與KH2PO4交互影響二十二碳六烯酸產(chǎn)量的預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot for the interaction effects of yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA

圖4 葡萄糖、酵母膏和KH2PO4影響二十二碳六烯酸產(chǎn)量的預(yù)測(cè)剖面圖Fig.4 Prediction profiler of glucose, yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA, respectively

通過觀察上述圖系，可以得出：回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即最大值點(diǎn)。對(duì) Y進(jìn)行嶺嵴分析，得到極大值所對(duì)應(yīng)的各顯著因素X1、X2、X5的編碼值分別為 0.488、0.000、0.000，即葡萄糖濃度為79.76g/L，酵母膏濃度為14g/L，KH2PO4濃度為0.5g/L，在此點(diǎn)預(yù)測(cè)的二十二碳六烯酸的產(chǎn)量為1.833g/L。X1、X2，X1、X5和 X2、X5的等高線都是橢圓，表明元素間的交互作用顯著[20]。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行5組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所測(cè)的二十二碳六烯酸的產(chǎn)量分別為1.810、1.815、1.807、1.814、1.809g/L，平均產(chǎn)量為1.811g/L，與模型預(yù)測(cè)值非常接近，表明設(shè)計(jì)模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況。

2.5 中試發(fā)酵試驗(yàn)

在優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，對(duì)突變株LS1057進(jìn)行了70L發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)。共進(jìn)行了3次中試發(fā)酵試驗(yàn)，三次發(fā)酵的平均發(fā)酵水平為：菌株生物量達(dá)到28.13g/L，總油脂含量為23.49%，二十二碳六烯酸終產(chǎn)量為2.112g/L，比搖瓶發(fā)酵的1.811g/L提高了16.62%。試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基能有效的提高隱甲藻LS1057生產(chǎn)二十二碳六烯酸的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響藻株LS1057代謝產(chǎn)生二十二碳六烯酸的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析，篩選出葡萄糖、酵母膏、K2HPO4為主要影響因素。然后通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逐步改變?nèi)叩臐舛?，逼近最佳響?yīng)面區(qū)域；最后根據(jù) Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，并結(jié)合響應(yīng)面的分析結(jié)果，確定了優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖79.76g/L，酵母膏14.0g/L、KH2PO40.5g/L、海鹽20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液(M液：VB10.6g/L，VB120.1mg/L)1%(V/V)。二十二碳六烯酸的發(fā)酵產(chǎn)量由原來的1.057g/L[11]提高到2.112g/L，增長了 99.81%。同時(shí)，回歸方程所得到的最大預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各篩選因素的影響，建立的模型與實(shí)際情況是比較吻合的，因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成是提高二十二碳六烯酸產(chǎn)量的有效途徑之一。

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