含乳飲料中甜蜜素的測定及提取方法的改進(jìn)

王飛，農(nóng)云軍，竇文淵，石燕麗（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

含乳飲料中甜蜜素的測定及提取方法的改進(jìn)

王飛，農(nóng)云軍，竇文淵，石燕麗
（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

對(duì)氣相色譜法測定含乳飲料中甜蜜素含量的方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，先用蛋白酶去除含乳飲料中的蛋白，使其變成澄清的溶液再按國標(biāo)方法提取衍生。在優(yōu)化的色譜條件下，甜蜜素的分離度高，線性范圍為0.10～1.00 mg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，定量限為0.005 g/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5.0%，回收率為96.7%～99.3%。結(jié)果表明，該方法前處理簡單方便，分析時(shí)間較短，精密度及準(zhǔn)確度高。

含乳飲料；甜蜜素；提取方法；改進(jìn)

甜蜜素的化學(xué)名稱為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種無營養(yǎng)、甜度高的人工合成甜味劑。人體過量攝入會(huì)產(chǎn)生致癌、致畸、損害腎功能等副作用[1-2]，所以許多國家禁止使用或是限制使用甜蜜素作為食品添加劑，我國在GB2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定其在飲料中最大使用量為0.65 g/kg。甜蜜素的測定方法主要有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、離子色譜法、比色法、薄層色譜法等[3-13]。目前最常用的是GB/T5009.97—2003《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中推薦的氣相色譜法[13]，因?yàn)槠淇焖?、簡便、靈敏度高而一直為業(yè)界所推崇。但是由于標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)時(shí)間比較早，受到實(shí)驗(yàn)條件和社會(huì)大環(huán)境的影響，制定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)在技術(shù)上受到一定的限制。

依國標(biāo)GB/T 5009.97—2003《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中規(guī)定的方法，目前對(duì)含乳飲料采用液體試樣的前處理方式，對(duì)于不同種類的液體樣品沒有詳細(xì)規(guī)定。但是，在實(shí)際的操作過程中，由于含乳飲料不是澄清的液體，存在著嚴(yán)重的沉淀和乳化現(xiàn)象，兩相之間分層不明顯，導(dǎo)致加標(biāo)回收率低，影響了測定的準(zhǔn)確性。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)含乳飲料的前處理方法進(jìn)行了細(xì)節(jié)改進(jìn)，優(yōu)化了色譜條件，使其前處理方法簡單，得到甜蜜素的分離色譜峰峰形好，方法回收率高、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限令人滿意。此方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速，有很高的推廣實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

含乳飲料：市售；環(huán)己基氨基磺酸鈉對(duì)照品：美國Sigma公司；液體蛋白酶（酶活力16 000 U）：諾維信（中國）投資有限公司；正己烷、氯化鈉、亞硝酸鈉、濃硫酸均為分析純：廣州試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A帶火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測器和7693自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent Chemstation色譜工作站：美國安捷倫公司；BSA124S-CW電子天平：德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1.000 g環(huán)己基氨基磺酸鈉對(duì)照品，用蒸餾水溶解定容于100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取10.0mg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)液0.10mL、0.20mL、0.40 mL、0.80 mL、1.00 mL分別于100 mL具塞比色管中，加水至10 mL，相當(dāng)于甜蜜素的質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL，置于冰浴中，充分冷卻后，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液5 mL，100 g/L硫酸溶液5 mL，搖勻，在冰浴中放置30 min，經(jīng)常搖動(dòng)，取出，準(zhǔn)確加入10.0 mL正己烷和5.0 g氯化鈉，密塞，手動(dòng)振搖80次，靜置分層，吸出正己烷層，超濾后裝進(jìn)樣瓶待測。

1.3.3 樣品處理

精密稱取含乳飲料樣品20.0 g，加入5 mL液體蛋白酶去除蛋白，室溫條件下放置10 min，離心取清液于100 mL比色管中，置冰浴中。按照國標(biāo)GB/T5009.97—2003《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》中規(guī)定的方法，加入50 g/L亞硝酸鈉溶液5mL，100g/L硫酸5mL，搖勻，在冰浴中反應(yīng)30 min，并經(jīng)常搖動(dòng)，然后準(zhǔn)確加入10.0 mL正己烷，5 g氯化鈉，振搖80次，待分層后吸出正己烷層用0.45 μm微孔濾膜過濾，上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)國標(biāo)方法的改進(jìn)

2.1.1 試樣制備方法的改進(jìn)

國標(biāo)方法中對(duì)于液體樣品的試樣制備是搖勻后直接取樣20.0g置于比色管中，冰浴后加入相應(yīng)的衍生試劑反應(yīng)30 min，再進(jìn)行萃取。但是含乳飲料樣品本身是一種乳白色的懸濁液，含有大量的蛋白質(zhì)，如果不進(jìn)行任何預(yù)處理就直接加入亞硝酸鈉和硫酸溶液衍生，含乳飲料中的蛋白質(zhì)在酸性條件下會(huì)發(fā)生變性而沉淀，大大影響了衍生效果，衍生效率只有40%～50%。因此，必須要先對(duì)含乳飲料進(jìn)行預(yù)處理得到澄清的液體再加入衍生劑和萃取劑才能得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，在國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上增加一步，先去除含乳飲料中的大量蛋白質(zhì)，回收率會(huì)大大提高，即采取先向樣品中加入5mL液體蛋白酶，搖勻，室溫放置10 min，離心得到澄清的樣品溶液，再按照國標(biāo)方法進(jìn)行提取衍生。此去除蛋白的方法比文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的更簡單易行。如果萃取過程發(fā)生乳化現(xiàn)象，可以根據(jù)樣品的差異采取離心的方式或是加入少許乙醇進(jìn)行消泡，有助于迅速分層。

2.1.2 樣品的保存時(shí)間的研究

眾所周知，通常衍生物的穩(wěn)定性較差，但是國標(biāo)方法中未提及樣品衍生后的保存及穩(wěn)定性問題。將處理好的樣品溶液放置在4℃冰箱中冷藏，間隔一定時(shí)間（0、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）測定其峰面積，發(fā)現(xiàn)甜蜜素衍生產(chǎn)物-環(huán)己醇亞硝酸酯隨著時(shí)間的推移峰面積會(huì)變小，放置3 h后已減小了4.3%，5 h后已衰減了10%，這說明甜蜜素衍生物會(huì)隨著時(shí)間的延長而慢慢分解，質(zhì)譜[5]證明其分解后生成了環(huán)己醇。由此可見，樣品提取完成后應(yīng)在5 h內(nèi)完成測定，如果是大批量樣品要把握好樣品的處理和上機(jī)測定時(shí)間，這樣才能保證樣品的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

2.1.3 色譜條件的選擇和優(yōu)化

國標(biāo)中采用的色譜條件為80℃恒溫，采用10%SE-30不銹鋼填充柱測定。目前石英毛細(xì)管柱較為普及，且分離效果較好，因此采用石英毛細(xì)管柱，分別比較了HP-1、RtxR-5、HP-innwax、FFAP等色譜柱，實(shí)驗(yàn)表明，RtxR-5柱的分離效果最好。為了避免較低溫度的恒溫操作會(huì)有殘留物干擾下次測定，采用60℃起溫，保持1 min，以15℃/min的速率升至150℃，保持3 min的程序升溫方法，甜蜜素的峰形和分離度更好，雜質(zhì)干擾小，保留時(shí)間適中，并且減少樣品中一些沸點(diǎn)較高的未知組分在色譜柱內(nèi)的殘留，適用于定量分析，結(jié)果見圖1。

圖1 甜蜜素對(duì)照品(A)和樣品中甜蜜素(B)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of sodium cyclamate standard(A)and sample solution(B)

2.2 線性范圍和定量限

取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在選定的色譜條件下測定，質(zhì)量濃度在0.10～1.00 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。甜蜜素的定量限（S/N=10）為0.005g/kg。本方法的定量下限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際樣品的添加量。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

用0.40 mg/mL的甜蜜素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣1.0 μL，重復(fù)6次，結(jié)果如表1所示，保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）分別為0.008%和1.05%，說明該方法精密度較好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Results of precision tests(n=6)

2.4 平行性實(shí)驗(yàn)

按照“1.3.3”方法處理方法，取某品牌乳酸飲料樣品均勻取樣6份，按照上述色譜測定條件對(duì)其中的甜蜜素含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示，RSD為2.75%，說明該方法具有良好的重復(fù)性，穩(wěn)定可靠，能滿足檢測要求。

表2 平行性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of parallel experiment

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取適量某品牌乳酸飲料樣品，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，按照“1.3.3”方法處理樣品，同時(shí)按加入約本底平均值50%～150%的對(duì)照品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 回收率測定結(jié)果(n=5)Table 3 Results of recovery experiment(n=5)

由表3可知，加標(biāo)回收率為96.7%～99.3%，RSD為1.10%～1.67%，說明該實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)論

對(duì)含乳飲料中甜蜜素含量的測定方法進(jìn)行了細(xì)節(jié)性改進(jìn)，在前處理時(shí)先加入蛋白酶去除蛋白，使其變成澄清的溶液再進(jìn)行提取衍生，驗(yàn)證了樣品的穩(wěn)定性時(shí)間為5 h，采用RtxR-5毛細(xì)管柱程序升溫檢測甜蜜素，其線性范圍為0.10～1.00 mg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，RSD＜5.0%，回收率為96.7%～99.3%，方法的定量限為0.005 g/kg。結(jié)果表明該方法前處理簡單方便，分析時(shí)間較短，靈敏度高，用于實(shí)際樣品的測定，結(jié)果令人滿意，該方法對(duì)乳飲料中其他添加劑的檢測有借鑒作用，為從事食品安全檢測人員提供了一定的參考信息，在保障食品安全方面有著重要的實(shí)際意義。

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Determination of sodium cyclamate in milk beverage and extraction method improvement

WANG Fei,NONG Yunjun,DOU Wenyuan,SHI Yanli

(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for sodium cyclamate content determination in milk beverage by gas chromatography was optimized.The protein in the milk beverage was removed by protease,and derived according to National Standard method.On conditions of optimized gas chromatography,the separating degree of sodium cyclamate was better,the linear detection range was 0.10-1.00 mg/ml(r=0.999 9)and the limit of quantity was 0.005 g/kg.The recovery rate and precision were in the range of 96.7%-99.3%and relative standard deviation(RSD)was less than 5.0%.Results indicated this method has simple pretreatment,shorter analysis time with high precision and accuracy.

milk beverage;sodium cyclamate;extraction method;improvement

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0095-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.021

2014-05-04

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7300055）；中國廣州分析測試中心自籌資金科研項(xiàng)目（20100008）

王飛（1979-），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称放c環(huán)境分析檢測。