半夏瀉心湯含藥血清對人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移細(xì)胞增殖的影響*

李東峰，趙聞平，劉喜平，明海霞，孫少伯，張 煒

1天水市中醫(yī)醫(yī)院急診科，甘肅 天水 741000；2甘肅省軍區(qū)干休所衛(wèi)生所；3甘肅中醫(yī)學(xué)院教育部“敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4蘭州大學(xué)第一醫(yī)院外科

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。胃癌細(xì)胞易脫落入腹腔，形成腹膜播散種植，約25%的胃癌患者在術(shù)前或術(shù)中有腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生。進(jìn)展期胃癌術(shù)后有40%～60%的患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致頑固性癌性腹水、腸道梗阻、惡液質(zhì)，成為患者死亡或影響預(yù)后的重要因素之一［1］。如何有效預(yù)防、及時(shí)阻斷腹膜轉(zhuǎn)移成為胃癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究就半夏瀉心湯含藥血清對人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移細(xì)胞GC9811-P的增殖進(jìn)行了初步觀察，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 家兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，共4只，由蘭州生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號：SYXK(甘)2004-0006，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：SCXK(甘)2004-006。

1.2 藥物及試劑 半夏瀉心湯藥材由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規(guī)定；培養(yǎng)液：含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液；消化液：0.25%胰蛋白酶消化液；5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracia、簡 5-FU)：用時(shí)采用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；RPMI-1640：GIBC Laboratories，USA生產(chǎn)；人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株GC9811-P由本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。

1.3 方法

1.3.1 半夏瀉心湯實(shí)驗(yàn)藥物的制備 按原處方比例稱取半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連2 g，人參9 g，大棗4 g，甘草9 g藥材飲片，置多能提取器中，加水煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5小時(shí)，第2次加6倍量水，煎煮1.0小時(shí)，合并2次煎液，離心濾過，濾液減壓濃縮至含生藥2 g/mL的浸膏，即得。

1.3.2 半夏瀉心湯含藥血清的制備 依照參考文獻(xiàn)［2］方法，實(shí)驗(yàn)前4只家兔禁食12小時(shí)，灌胃給藥，半夏瀉心湯藥物組2只家兔灌服半夏瀉心湯，空白組2只家兔給予相同體積的生理鹽水。給藥劑量：每次26mL/kg，相當(dāng)于60 kg成人日服用量的10倍；給藥方式：連續(xù)灌胃3次,第1、2次間隔20小時(shí)，第2、3次間隔4小時(shí)；采血時(shí)相：第3次給藥后2小時(shí)無菌條件下心臟采血，靜置4小時(shí)，3 000 r/min離心20分鐘，分離血清(藥物血清，DS)，同種條件下藥物血清混勻，56℃，30分鐘水浴滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝?jīng)培養(yǎng)沒有微生物生長。

1.3.3 MTT法測定半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞的敏感性 將人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株GC9811-P用含有青、鏈霉素各100 U/mL、15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用MTT法即選擇指數(shù)生長期的GC9811-P細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×108/L，接種于96孔板，每孔接種100μL，另加培養(yǎng)基 100μL；37℃，5mL/LCO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，吸棄上清液。取對數(shù)生長期的GC9811-P細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)95%以上，先用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μL。分組：含藥血清組(在細(xì)胞液中加入最終濃度分別為5%、10%的半夏瀉心湯含藥血清)，空白血清組(加正常家兔血清對照組)。將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)后，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μLDMSO。在490 nm波長下，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度A值，按下列公式求出細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=含藥血清組吸光度A/空白血清組吸光度A×100%。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)4次，根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s，n=3)。

1.3.4 臺盼蘭染色法測定半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞生長的影響 取一瓶對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)95%以上。用含有15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)為2～3×105個(gè)/mL，接種于96孔塑料培養(yǎng)板中。分組同“1.3.3”項(xiàng)。置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24、48、72小時(shí)。取出后，加入4%臺盼蘭染液，顯微鏡下計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)。顯蘭色的為死細(xì)胞，未顯色的為活細(xì)胞，按下列公式：

細(xì)胞生長抑制率(%)=［(空白血清組活細(xì)胞數(shù)-含藥血清組活細(xì)胞數(shù))/空白血清組活細(xì)胞數(shù)］×100%

每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s，n=3)。

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞敏感性的影響 與空白血清組比較，半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞的細(xì)胞存活率有一定的影響，吸光度A值有明顯差異(P＜0.05)；細(xì)胞存活率在48小時(shí)最為明顯，但濃度之間的差異并不顯著，見圖 1、表 1。

圖1 不同濃度含藥血清對細(xì)胞存活率的影響

表1 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞敏感性的影響(χ±s)

2.2 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞生長的影響 與空白血清組比較，不同濃度半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞生長都有一定的抑制作用，在48小時(shí)最為明顯，且與含藥血清濃度存在正相關(guān)，即隨濃度上升表現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)，見表 2、圖 2。

表2 半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P細(xì)胞生長的影響(χ±s)

圖2 不同濃度含藥血清對細(xì)胞抑制率的影響

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)雖沒有與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相對應(yīng)的病名，但有與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移臨床特征相類似的描述，如“胃脘痛”“噎嗝”“痞滿”“呃逆”“積聚”“反胃”等。胃癌晚期或術(shù)后形成腹膜轉(zhuǎn)移大多具有本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)。本虛主要以脾胃虛弱為主，標(biāo)實(shí)主要以痰濁和癌毒阻滯為主，痰滯成積既是胃癌的病理表現(xiàn)，又是胃癌形成和進(jìn)一步發(fā)展的病因，“痰之為物，隨氣升降，無處不到”。痰滯與胃癌易于浸潤轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)相類似。手術(shù)以后，正氣受戕，脾失健運(yùn)，水濕運(yùn)化失司，易促進(jìn)痰濁的再次生成，恰好又為胃癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了物質(zhì)條件。而癌毒流竄走注是胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的根本原因，癌毒停積它處，繼續(xù)阻隔經(jīng)絡(luò)氣血，釀生痰瘀，癌毒與痰瘀搏結(jié)，則又形成腫塊［3］。以上諸多因素，均可影響氣機(jī)的正常升降。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為本病臨床辨證多為復(fù)合證型，其特點(diǎn)以虛實(shí)夾雜、寒熱互結(jié)為主，病機(jī)關(guān)鍵在于升降失調(diào)，辛開苦降是其關(guān)鍵治法。

半夏瀉心湯出自《傷寒論》，主治寒熱錯(cuò)雜之痞證，為辛開苦降法的代表方劑。近年來本方在胃癌的防治中已取得較好的臨床療效［4-6］。本方突出辛開苦降，升降同調(diào)，以復(fù)中焦之升降。同時(shí)兼益氣健脾，調(diào)理脾胃以扶正，具有寒熱并用，溫而不燥，寒而不遏之特點(diǎn)。配伍嚴(yán)謹(jǐn)，藥少力專，與胃癌的中醫(yī)主要病機(jī)十分吻合。課題前期研究表明半夏瀉心湯含藥血清可抑制人胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡，并從抗氧化、下調(diào)bcl-2及p53等胃癌相關(guān)表達(dá)基因方面探討了半夏瀉心湯防治胃癌的作用機(jī)理［7-8］。

GC9811-P為胃癌細(xì)胞經(jīng)腹腔連續(xù)傳代，隨著腹膜轉(zhuǎn)移率增高的演進(jìn)，得到一株腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，腹膜轉(zhuǎn)移形成率為100%［9］。本研究表明，半夏瀉心湯含藥血清對GC9811-P較為敏感，對其增殖有明顯的抑制作用，且有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。提示辛開苦降法可能是中醫(yī)藥防治胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的主要治法之一，并為其提供了重要線索，至于本方在體內(nèi)對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)理，尚需要進(jìn)一步研究。

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［3］ 程海波，吳勉華.周仲瑛教授“癌毒”學(xué)術(shù)思想探析［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(6)：866-869.

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