苦瓜葉片提取液對(duì)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)抑制作用的初探

單少杰，李 翔，郭紅梅，陳 宏

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

苦瓜（Momordica Charantia L.）系葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬（Momordica）攀緣性草本植物.多種古籍記載，苦瓜葉片具有治療胃痛、痢疾、療瘡腫毒和驅(qū)蟲(chóng)等功效[1].近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道苦瓜果實(shí)提取物具有良好的廣譜抗菌功效，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭氏陽(yáng)性桿菌（如枯草桿菌）和革蘭氏陰性桿菌（如大腸桿菌）等具有明顯的抑菌效果[2-4].苦瓜葉片作為果實(shí)以外的副產(chǎn)物，雖然無(wú)法食用，但其提取物能夠有效抑制某些農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，如小菜蛾、斜紋夜蛾、美洲斑潛蠅等[5-7]，因此可以作為綠色環(huán)保的害蟲(chóng)抑制劑應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中.目前研究多針對(duì)苦瓜葉片提取物對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的抑制作用，對(duì)菌類(lèi)抑制作用的報(bào)道較少.

農(nóng)桿菌（Agrobacterium）是一類(lèi)普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，生活在植物根表面，依靠由根組織滲透出來(lái)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存.農(nóng)桿菌吸附在植物根部后，將自身DNA導(dǎo)入到植物根部，被侵染的植物會(huì)出現(xiàn)根部膨大、生長(zhǎng)緩慢、矮小等癥狀.

本研究以無(wú)水乙醇為萃取液，制備苦瓜葉片提取液并處理農(nóng)桿菌，觀測(cè)其生長(zhǎng)情況.目的是為進(jìn)一步研究苦瓜葉片的抗菌機(jī)制提供參考，也為其開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌種與植物

菌種：農(nóng)桿菌，天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院欒維江教授實(shí)驗(yàn)室提供.

植物：苦瓜（長(zhǎng)豐三號(hào)），由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供種子，在天津市西青區(qū)精武鎮(zhèn)種植.采收葉片，用去離子水洗凈，真空干燥后保存?zhèn)溆?

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜葉片乙醇提取液的制備

具體制備方法參照文獻(xiàn)[5].

1.2.2 液態(tài)培養(yǎng)基的制備

取250mL雙蒸水，加入蛋白胨2.5g，酵母粉1.25g，氯化鈉2.5g，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱滅菌后，每4mL為1份，分裝至試管中.每份加入4μL利福平抗生素，將制備好的液態(tài)培養(yǎng)基混勻，備用.

1.2.3 實(shí)驗(yàn)處理

將苦瓜葉片提取液設(shè)置4種質(zhì)量濃度（3.1、6.3、12.5、25.0g/L），同時(shí)用清水（CK1）和乙醇（CK2）作為對(duì)照，共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次.分別在各處理組中加入制備好的液態(tài)培養(yǎng)基1份，同時(shí)接種農(nóng)桿菌，將各處理菌液置于28℃、200r/min環(huán)境下培養(yǎng).對(duì)菌液每12h進(jìn)行1次吸光度值D（λ）600的測(cè)量.因苦瓜葉片乙醇提取液本身為綠色，為消除提取液自身顏色對(duì)吸光度的影響，另配制每個(gè)濃度下未接種農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基，測(cè)量吸光度值.最終測(cè)量值為含菌培養(yǎng)液的吸光度值減去不含菌培養(yǎng)液的吸光度值.

1.3 數(shù)據(jù)處理

以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析.

2 結(jié)果與分析

根據(jù)在600nm處測(cè)得的培養(yǎng)基吸光度值的變化，可以看出不同處理濃度和不同時(shí)間農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表1所示.

表1 農(nóng)桿菌培養(yǎng)液在不同時(shí)間的D（λ）600Tab.1 D（λ）600of cultivation liquid of Agrobacterium at different time

由表1可以看出，CK1和CK2處理組D（λ）600相近，都顯著高于苦瓜葉片乙醇提取液中的D（λ）600.隨著提取液濃度的增大，農(nóng)桿菌培養(yǎng)液的D（λ）600呈下降趨勢(shì)，但在6.3、12.5和25.0g/L 3個(gè)處理濃度下，培養(yǎng)液D（λ）600的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

為了更清晰地分析苦瓜葉片提取液對(duì)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的影響，作生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示.

圖1 農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curves of Agrobacterium

從處理濃度上來(lái)看，在4個(gè)時(shí)間段中，苦瓜葉提取物質(zhì)量濃度為3.1g/L的處理組與其余各處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p≤0.05）.由圖1可以看出，在處理12h時(shí)，質(zhì)量濃度為3.1g/L的處理組與6.3、12.5、25.0g/L處理組之間就開(kāi)始出現(xiàn)差異，同對(duì)照組相比，此時(shí)農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)已受到抑制，證明該濃度即為抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的有效濃度.隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，D（λ）600均逐漸增大，表明培養(yǎng)液中農(nóng)桿菌數(shù)量逐漸增多.4個(gè)苦瓜葉提取物處理組的吸光度值均顯著低于2個(gè)對(duì)照組，表明苦瓜葉提取物對(duì)農(nóng)桿菌具有抑制作用.其中質(zhì)量濃度為3.1g/L處理組的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)同其他處理組始終差別較大，而且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，差別也逐漸增大.其余3種濃度下農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本重合，由此可見(jiàn)，這3種濃度的苦瓜葉提取物對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果近似.

從作用時(shí)間來(lái)看，對(duì)照組、質(zhì)量濃度為3.1g/L處理組在4個(gè)時(shí)間段的菌液濃度始終呈上升趨勢(shì)；質(zhì)量濃度為6.3、12.5、25.0g/L的處理組在36h之前為農(nóng)桿菌的快速生長(zhǎng)期，36h和48h之間菌液濃度達(dá)到最大，這說(shuō)明處理時(shí)間達(dá)到36h后，農(nóng)桿菌數(shù)量趨于穩(wěn)定.

由此表明，4個(gè)苦瓜葉提取物處理組中，質(zhì)量濃度為3.1g/L的提取物開(kāi)始對(duì)農(nóng)桿菌產(chǎn)生顯著的抑制效果，但抑菌能力出現(xiàn)大幅度變化的臨界質(zhì)量濃度為6.3 g/L，濃度再增大時(shí)，抑菌效果已沒(méi)有顯著提升.

3 結(jié)論

本研究表明，苦瓜葉片提取液確實(shí)可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng).在4個(gè)處理濃度中，以6.3 g/L為抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的最適處理濃度.在4個(gè)時(shí)間段中，以24h為最佳的處理時(shí)間.

[1] 李承祜.藥用植物學(xué)[M].上海：科學(xué)出版社，1949.

[2] 張緒忠.苦瓜抗菌作用的研究[J].中草藥，1995，26（10）：556-559.

[3]張瑞其，馬廉蘭，呂軍華.苦瓜葉的抑菌試驗(yàn)[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，23（3）：272-273.

[4]王杰，張名位，劉興華.苦瓜提取物的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2004（4）：56-58.

[5] 郭紅梅，陳波，陳宏，等.苦瓜葉片正丁醇萃取液對(duì)小菜蛾取食及生理特性的影響[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，33（1）：82-84.

[6] 駱?lè)f，張茂新，凌冰.苦瓜葉乙酸乙酯萃取物對(duì)斜紋夜蛾消化酶活性的影響[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2012，34（3）：289-294.

[7] 凌冰，向亞林，張茂新，等.苦瓜葉提取物對(duì)美洲斑潛蠅取食和產(chǎn)卵行為的抑制作用[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（4）：836-842.