蝦夷馬糞海膽NLR 家族基因片段的克隆及表達特征分析

陳亞東，劉曉飛，常亞青，仇雪梅，王秀利，劉洋

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023)

NLR 家族(the nucleotide -binding domain and leucine-rich repeat containing gene family)屬于模式識別受體［1-2］的重要一員，同源于植物抗病R蛋白，主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，識別進入細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)，包括細菌組分、肽聚糖和核酸等［3］。目前已經(jīng)有多種NLR 分子被發(fā)現(xiàn)，它們都具有保守的結(jié)構(gòu)域:N 端可變區(qū)域、中間保守的NBD(nucleotide - binding domain)結(jié)構(gòu)域和C 端的LRR(leucine-rich repeats)結(jié)構(gòu)域。LRR 結(jié)構(gòu)域的主要作用是識別包括細菌及真菌的一些細胞組分、病毒的核酸等［4-5］。N 端可變區(qū)域主要作用是和其他蛋白結(jié)合，傳遞接收到的抗原信號，是效應(yīng)區(qū)，但有一些NLR 分子沒有明顯的N 端結(jié)構(gòu)域［6］。N 端可變區(qū)域的不同變化對于NLR 蛋白激活不同后續(xù)免疫過程具有重要意義。NBD 結(jié)構(gòu)域是NLR 分子多聚化所需要的結(jié)構(gòu)。

根據(jù)N 端結(jié)構(gòu)域的不同，NLR 家族可分為五類:NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX［7］。這些NLR 家族蛋白分子位于細胞質(zhì)內(nèi)，識別特異的微生物組分，最終激活NF-κB 信號通路，再調(diào)控表達IL -8、COX -2、IL -1β和抗菌肽等基因，進行免疫反應(yīng)，以達到保護機體不受外來病原菌侵擾的目的［8］。紫球海膽Strongylocentrotus purpuratus基因組內(nèi)存在208 個NLR 家族基因，種類比人類NLR 家族(20種)豐富得多［9］。Hibino等［10］對紫球海膽的NLR 家族基因進行了聚類分析，并進一步劃分出9 組亞類，也進行了初步的實時定量表達分析。蝦夷馬糞海膽與紫球海膽基因組具有高度的同源性，有關(guān)紫球海膽的NLR 家族基因的研究結(jié)果可為研究蝦夷馬糞海膽NLR 家族基因提供參考。

蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotus intermedius 原產(chǎn)于日本北海道及以北沿海，在俄羅斯遠東地區(qū)的薩哈林島等地也有分布。大連海洋大學(xué)于1989年將其從日本引入中國，現(xiàn)已成為中國北方沿海特別是遼東和山東半島重要的養(yǎng)殖種類，養(yǎng)殖規(guī)模越來越大。海膽作為一種模式生物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究。目前，對海膽生物學(xué)的研究主要集中在繁殖育苗［11-12］、餌料、疾病和營養(yǎng)等應(yīng)用研究，也有關(guān)于細胞學(xué)［13］、分子標記［14-16］和功能基因克隆與分析［17-18］等基礎(chǔ)研究，但對蝦夷馬糞海膽免疫系統(tǒng)分子水平的相關(guān)研究在國內(nèi)尚未見報道。NLR 家族作為重要的免疫基因家族，其研究結(jié)果可以促進蝦夷馬糞海膽免疫系統(tǒng)分子機制的研究。本研究中克隆了蝦夷馬糞海膽NLR 家族基因編碼區(qū)的保守序列，分析了核酸和氨基酸序列的多樣性，采用半定量RT-PCR 技術(shù)檢測了NLR 基因在不同組織中的表達，以期為研究蝦夷馬糞海膽天然免疫系統(tǒng)中NLR 分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用2 齡蝦夷馬糞海膽取自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，海膽飼養(yǎng)于16 ～25 ℃的海水中，每日投喂新鮮海帶。抽取體腔細胞前一日停止投喂。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的制備及cDNA 的合成 選取8 枚健康海膽(雌、雄各4 枚)，分別使用注射器抽取蝦夷馬糞海膽的體腔液，在4 ℃下以5000 r/min 離心10 min，收集體腔細胞，活體解剖蝦夷馬糞海膽，取其圍口膜、腸、管足、雌雄性腺等組織，液氮凍存，于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照EasyPureTMRNA Kit 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)的方法提取各組織的總RNA，用凝膠電泳檢測總RNA 的質(zhì)量，-80 ℃下保存?zhèn)溆?。為了減少個體差異及性別對試驗結(jié)果的影響，各組織均使用4 枚海膽的RNA等量混合后用于反轉(zhuǎn)錄，其中精巢、卵巢各使用4 枚雄性或雌性海膽，其他組織均使用2 枚雌性和2 枚雄性海膽，混合后分別使用cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于冰箱(-20 ℃)中保存，用于后續(xù)基因克隆及半定量分析。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)已報道的紫球海膽NLR 家族基因的編碼區(qū)序列［10］，比對分析同一聚類的編碼區(qū)的同源序列，根據(jù)保守區(qū)序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物11 對，用于NLR 基因部分序列的克隆和半定量RT -PCR 分析。除NLR5、NLR6和內(nèi)參18S rRNA 引物為特異性引物外，其他為簡并引物，其中，內(nèi)參基因的引物根據(jù)Gen-Bank 中蝦夷馬糞海膽的18S rRNA 序列設(shè)計(Accession:D14365)。所有引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

1.2.3 NLR 部分基因片段的擴增及回收測序 蝦夷馬糞海膽NLR 基因片段擴增的PCR 反應(yīng)體系(50 μL):ddH2O 36.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL;10 × Taq buffer 5 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL;cDNA 模板2 μL;Taq 酶0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s，退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物質(zhì)量。最后用凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)純化回收目的條帶，將純化后的目的片段連接至PMD19 -T 載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，在附加氨芐青霉素、IPTG、X - gal 的LB 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃)12 ～16 h，挑取白色單菌落小量培養(yǎng)，使用PMD19 -T 通用引物進行菌液PCR 擴增，擴增體系和程序與上述相同，各選取10 個有目的基因插入的陽性單克隆菌液送樣測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果使用BlastX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件進行比對，用NCBI 的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索并預(yù)測蛋白的保守區(qū)域，按照正確的閱讀框進行翻譯，對氨基酸序列進行比對，由Clustal X 程序完成氨基酸序列多重比對分析。使用DNAStar 軟件進行基因及氨基酸序列相似性的比對計算。

1.2.5 半定量RT-PCR 分析 對擴增得到基因片段進行比對，確認為蝦夷馬糞海膽中NLR 家族的基因后，使用表1 中引物，采用半定量RT -PCR法檢測各組NLR 基因的表達情況。選取蝦夷馬糞海膽18S rRNA 作為內(nèi)參基因。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，PCR 擴增基因片段時基因及內(nèi)參基因的引物都可以在55 ℃下獲得較好的效果，因此，半定量的退火溫度統(tǒng)一選用了55 ℃;預(yù)試驗中，內(nèi)參基因選取了18、19、20、21、22共5 個循環(huán)數(shù)，目的基因選取了26、28、30、32共4 個循環(huán)數(shù)，以求獲得達到較好擴增效果時的循環(huán)數(shù)，最終發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因在18 個循環(huán)、目的基因在30 個循環(huán)數(shù)時擴增效果最好。

以根據(jù)內(nèi)參基因調(diào)整濃度一致后的6種組織的cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增程序:94℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下再延伸1 min，進行18 或30 個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量。

表1 NLR 基因克隆引物Tab.1 Primers used for cloning of NLR genes

2 結(jié)果與分析

2.1 NLR 部分基因片段的克隆

經(jīng)電泳檢測獲得了預(yù)期中的9 組NLR 基因聚類:NLR1、NLR3、NLR4、NLR5、NLR6、NLR7、NLR8.2、NLR8.3、NLR9。NLR2 組基因擴增未得到結(jié)果。為探索各組NLR 基因的序列多樣性，本研究中各選取10 個單克隆進行測序，獲得各組NLR 基因的部分序列。

2.2 蝦夷馬糞海膽NLR 基因部分序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)過BlastX 比對發(fā)現(xiàn):克隆得到9 組基因均含有NACHT和LRR and PYD domains-containing protein 類似蛋白，保守區(qū)域均為NACHT 結(jié)構(gòu);與紫球海膽NLR 基因的同源性最高，與設(shè)計引物所使用的模板基因均達到70%以上的序列相似度。將NLR 基因核酸序列按照正確的閱讀框進行翻譯，獲得了編碼的氨基酸序列，并使用Clustal X 1.8 軟件對氨基酸序列進行序列比對，同時使用DNAStar軟件分別進行核酸和氨基酸序列比對計算，相似性為100%。

對測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，NLR4、NLR6、NLR8.3、NLR9.1 組基因在10 個測序結(jié)果中存在完全一致的序列，其余5 組NLR 基因未出現(xiàn)完全一致的序列。同組內(nèi)的NLR 基因序列也存在核酸和氨基酸序列長度和組成差異，其中NLR7 組基因的多樣性最高，10 個測序結(jié)果中存在8種不同的序列長度，其次為NLR8.2 及NLR5 組，分別存在5種和4種不同長度的序列，其余NLR 基因組存在2 ～3種不同長度的序列(表2)。

此外，通過Clustal X 序列比對發(fā)現(xiàn)，同一聚類的氨基酸序列存在多種差異，存在序列變化最多的是NLR7 組，有些序列存在較長的氨基酸序列缺失，如NLR7 -6在160 ～190 號氨基酸之間比其他序列缺失22 個氨基酸(圖1)。其余組的NLR 基因也都存在類似的差異。本試驗中總共獲得了有差異的NLR 家族基因序列80 條，可以看出，NLR 家族存在許多成員，尤其以NLR7 組的基因序列差異最大。

表2 NLR 基因cDNA 及氨基酸序列多樣性分析Tab.2 Analysis of diversity and amino acid sequence of NLR cDNA

圖1 采用Clustal X 1.8 軟件對NLR7 組氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.1 Alignment of deduced amino-acid sequences of NLR7 by Clustal X 1.8

2.3 半定量RT-PCR 分析

提取蝦夷馬糞海膽體腔細胞、圍口膜、腸、管足、雄性性腺、雌性性腺組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后在擴增效果好的循環(huán)數(shù)及退火溫度下對NLR 家族基因進行半定量RT -PCR 分析，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測可看出，不同分組的NLR 基因在不同組織中的表達情況表現(xiàn)出差異(圖2)。

從不同組織的擴增結(jié)果可以看出，NLR 基因在6種組織中均有擴增，從產(chǎn)物濃度來看，除NLR9 組在雄性性腺及腸中表達量最高并與其他組織存在明顯差異外，其余基因在6種組織中的表達量未見有明顯差異。NLR3 組整體表達量較低，僅在精巢中表達量達到一定水平，在其余組織中的表達量微弱。NLR 家族各基因在圍口膜、性腺、腸中均有較高水平表達，在體腔細胞和管足中表達水平也較高，各家族間基因表達量存在部分差異，但未有較大浮動(圖2)。

總體看來，NLR1、NLR3、NLR4 組基因處于較 低 的表達 水 平，而 NLR5、NLR6、NLR7、NLR8.2、NLR8.3、NLR9.1 組基因處于較高的表達水平，比較基因家族序列結(jié)果來看，基因和氨基酸序列差異越大的基因家族聚類，在各種組織中的表達量就越高。對比不同家族的表達量發(fā)現(xiàn)，序列差異最大的家族聚類NLR7、NLR8.2，表達量都處于較高水平。這可能與這兩組基因的功能相關(guān)，推測這兩組基因在蝦夷馬糞海膽的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。

3 討論

NLR 家族作為重要的固有免疫體系中的一員，表達的多樣性極大地影響蝦夷馬糞海膽抗病力的強弱，其他物種中也存在著較多的NLR 分子，Huang等［19］研究發(fā)現(xiàn)，文昌魚基因組中有118 個NLR 分子。紫球海膽基因組測序完成后，通過基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其存在208 個NLR 家族基因，種類比人類NLR 家族(20種)豐富得多［9］。通過對這3種物種的對比發(fā)現(xiàn)，越是低等的物種中NLR 基因家族越豐富，NLR 基因在低等動物的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。研究NLR 家族基因可以有效了解低等動物體內(nèi)的免疫反應(yīng)基本機制。本研究中，利用設(shè)計的NLR 引物進行PCR 擴增獲得了蝦夷馬糞海膽的9 組NLR 家族聚類基因片段，證明了NLR 家族基因在蝦夷馬糞海膽各組織中都存在表達，而且通過對同一組基因的大量測序結(jié)果比對分析發(fā)現(xiàn)，每一個聚類都存在多個成員，在cDNA 長度上、基因序列上都存在差異。翻譯后的氨基酸序列同樣存在長度和氨基酸序列的變化。本研究中，共克隆出80 條蝦夷馬糞海膽NLR 家族基因的部分序列，并且具有序列差異，可以看出，NLR 家族基因的多樣性極高。NLR是細胞內(nèi)的模式識別受體，主要功能是識別外來抗原，正是因為NLR 家族基因具有如此的多樣性，才能夠滿足類別多樣的抗原識別要求。

圖2 蝦夷馬糞海膽NLR 基因在不同組織中表達的RT-PCR 分析Fig.2 Expression of NLRs in tissues of sea urch Strongylocentrotus intermedius using RT-PCR

從半定量RT-PCR 檢測結(jié)果來看，NLR 基因作為重要的免疫基因，在蝦夷馬糞海膽各組織中都存在表達，在不同組織中都處于高效表達的狀態(tài)，但表達量存在些許差異。腸道及性腺表達量普遍較高，這符合已有研究中發(fā)現(xiàn)的NLR 家族在腸道中的表達量最高的結(jié)果［6］。

結(jié)合測序結(jié)果及半定量分析結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，同一NLR 家族聚類在DNA 序列及氨基酸序列上均存在差異，有些組差異較大，而且序列差異越大表達量就越高，這對于海膽免疫外界病原體的入侵以及對入侵后病原體的及時處理可能起著至關(guān)重要的作用。海膽體內(nèi)只存在先天性免疫系統(tǒng)抵抗外界侵擾，成年海膽體腔內(nèi)的體腔細胞主要承擔對外界病原侵擾的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并通過對外來物質(zhì)的吞噬和封裝功能來實現(xiàn)。海膽體腔內(nèi)含有多種體腔細胞，各自發(fā)揮不同的免疫功能［20-21］。本研究中，腸及圍口膜的高效表達可能與長期接觸外來病原體有關(guān)。本研究中獲得了蝦夷馬糞海膽的部分NLR家族基因序列，并對其不同組織的表達多樣性進行了研究，為后續(xù)NLR 基因作用機制的探究及優(yōu)良抗病海膽家系的篩選奠定了基礎(chǔ)。

［1］Medzhitov R，Janeway C A.Innate immunity:the virtues of a nonclonal system of recognition［J］.Cell，1997，91(3):295 -298.

［2］Medzhitov R，Janeway C A.Decoding the patterns of self and oneself by the innate immune system［J］.Science，2002，296:298 -300.

［3］Medzhitov R.Recognition of microorganisms and activation of the immune response［J］.Nature，2007，449:819 -826.

［4］Nimchuk Z，Eulgem T，Holt B F，et al.Recognition and response in the plant immune system［J］.Annual Review of Genetics，2003，37(1):579 -609.

［5］Nürnberger T，Brunner F，Kemmerling B，et al.Innate immunity in plants and animals:striking similarities and obvious differences［J］.Immunological Reviews，2004，198(1):249 -266.

［6］Ting J P Y，Davis B K.CATERPILLER:a novel gene family important in immunity，cell death，and diseases［J］.Annu Rev Immunol，2005，23:387 -414.

［7］Ting J P Y，Lovering R C，Alnemri E S P D，et al.The NLR gene family:an official nomenclature［J］.Immunity，2008，28(3):285.

［8］Kufer T A，F(xiàn)ritz J H，Philpott D J.NACHT - LRR proteins(NLRs)in bacterial infection and immunity［J］.Trends in Microbiology，2005，13(8):381 -388.

［9］Sodergren E，Weinstock G M，Davidson E H，et al.The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus［J］.Science，2006，314:941 -952.

［10］Hibino T，Loza-Coll M，Messier C，et al.The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome［J］.Developmental Biology，2006，300(1):349 -365.

［11］常亞青，王子臣，宋堅，等.四種海膽雜交的可行性及子代的早期發(fā)育［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2000，24(3):211 -216.

［12］李世英，張明，高緒生，等.大連近海蝦夷馬糞海膽生殖周期的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2000，15(1):60 -64.

［13］丁君，常亞青，王長海，等.不同種海膽體腔細胞類型及體液中的酶活力［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2006，13(1):33 -38.

［14］仇雪梅，吳領(lǐng)知，郭曉黎，等.蝦夷馬糞海膽CYP51 基因cDNA的克隆及其SNPs 分析［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(4):294 -299.

［15］Wang Xiuli，F(xiàn)eng Teng，Yang Lei，et al.dbEST - derived SSR markers in sea urchin(Hemicentrotus pulcherrimus)［J］.Conservation Genetics，2009，10(3):729 -731.

［16］Wang Xiuli，Qiu Xuemei，Meng Xiangying.Preliminary study on polymorphism analysis of SpRunt - 1 gene by PCR - SSCP in Strongylocentrotus intermedius and its association with growth traits［J］.Molecular Biology Reports，2010，37(1):411 -415.

［17］丁君，孫巍，常亞青.蝦夷馬糞海膽性腺cDNA 文庫構(gòu)建及部分EST 序列分析［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18(1):222 -229.

［18］丁君，孫巍，常亞青.蝦夷馬糞海膽硬脂酰輔酶A 去飽和酶和蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆與表達［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2012，27(6):489 -494.

［19］Huang S，Yuan S，Guo L，et al.Genomic analysis of the immune gene repertoire of amphioxus reveals extraordinary innate complexity and diversity［J］.Genome Research，2008，18(7):1112-1126.

［20］Smith L C，Rast J P，Brockton V，et al.The sea urchin immune system［J］.Invertebrate Survival Journal，2006(3):25 -39.

［21］Smith L C.Diversification of innate immune genes:lessons from the purple sea urchin［J］.Disease Models＆ Mechanisms，2010，3(5/6):274 -279.