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    海星中抑制ACE 活性的甾體化合物的分離純化

    2014-02-15 08:01:30田麗冉朱春芃曲敏佟長青金橋譚成玉李偉
    大連海洋大學(xué)學(xué)報 2014年4期
    關(guān)鍵詞:甾體海星粗提物

    田麗冉,朱春芃,曲敏,佟長青,金橋,譚成玉,李偉

    (1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連116023;2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧 大連116023)

    甾體化合物具有軟化血管、活血、強心、抗炎、鎮(zhèn)靜、促進生長發(fā)育等生理活性,并在生殖活動過程中起著重要的作用[1-3]。海星中甾體化合物含量豐富,基本上每種海星都含有甾體類化合物[4]。從海星中得到的甾體化合物,大部分具有3β、6α(或6β)、8β、15α(或15β)、16β - 多羥基膽甾烷母核的結(jié)構(gòu),有時在4β、5α、7α(或7β),偶爾在14α 位置具有一個或多個羥基,且一般支鏈具有25(S)羥基[5-6]。海洋甾體化合物因支鏈豐富多樣、骨架結(jié)構(gòu)新奇、生理活性獨特而備受關(guān)注[7]。但目前尚未見對海星中具有抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的化學(xué)成分的研究,本研究中,以抑制ACE 活性為篩選模型,對海星總甾體化合物進行提取、分離純化,旨在為海星甾體類物質(zhì)降血壓藥物的開發(fā)提供理論和試驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗用多棘海星Asterias amurensis 采自大連市黑石礁海域。

    試驗試劑主要有:硅膠(200 ~300 目)、薄層層析板(自制)、血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(Sigma 公司)、馬尿酸(Sigma 公司)、Hip-His-Leu(Sigma 公司)、齊墩果酸標準品(天津飛鷹制藥有限公司),香草醛、濃硫酸、甲醇(色譜醇,Sigma公司)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、Na2B4O7、H3BO7、CF3COOH等均為分析純。

    試驗儀器主要有:高效液相色譜儀(南京科捷分析儀器有限公司),色譜柱(SinoChrom ODS-BP E1722557,大連依利特公司),UV1750 紫外分光光度計(島津儀器有限公司),冷凍干燥機(北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司),RE -52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),SY2 -4 型電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠),PHS -25C型數(shù)顯酸度計(上海創(chuàng)發(fā)電子科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 海星總甾體化合物的提取 取20 kg 海星剪碎,于體積分數(shù)為70%的乙醇中熱浸提2次,每次2 h,過濾,取上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮得到水溶液,即海星乙醇粗提物,于冰箱(-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

    依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對提取到的水溶液進行多次萃取,直至有機層基本無色,濃縮,分別得到石油醚萃取部分(65 g)、乙酸乙酯萃取部分(130 g)和正丁醇萃取部分(150 g)。

    1.2.2 海星總甾體化合物的分離 將正丁醇部分(150 g)進行硅膠柱色譜,以乙酸乙酯與甲醇的混合液(體積比分別為100∶ 0 ~9、10 ~1∶ 1)進行梯度洗脫,每個比例洗脫5 ~8 個柱體積,分別收集洗脫液,濃縮,通過薄層色譜分析合并流分,得到F1~F88 個亞組分。

    1.2.3 海星總甾體化合物的鑒定 利用醋酸酐-濃硫酸反應(yīng)(Liebermann -Burchard,L -B 反應(yīng))檢測所得到的物質(zhì)是否為甾體化合物。將樣品溶于冰醋酸中,加入醋酸酐與濃硫酸混合液(體積比為20∶ 1),觀察顏色的變化。

    1.2.4 海星總甾體化合物含量的測定 甾體化合物可與香草醛-硫酸溶液發(fā)生反應(yīng),呈灰綠色,于540 nm 處有最大吸收峰,故常用此方法測定甾體化合物的含量[8]。

    分別取濃度為400 μg/mL 的齊墩果酸標準品溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,注入具塞試管中,各加入體積分數(shù)為95%的乙醇0.45、0.40、0.30、0.20、0.10、0 mL,補足至0.50 mL,再分別加入0.50 mL 8%的香草醛試劑,搖勻,置于水浴中緩慢加入5 mL 72%的硫酸,搖勻,立即放入62 ℃恒溫水浴中保溫20 min,迅速取出置于水浴中冷卻10 min,在540 nm 處測定吸光度,繪制標準曲線。

    分別取適量的海星乙醇粗提物以及石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層中的總甾體化合物,配成一定濃度的溶液,用香草醛-硫酸反應(yīng)進行測定,操作方法同標準曲線的繪制。各溶劑中總甾體化合物的含量根據(jù)標準曲線求出。

    1.2.5 ACE活性的測定參考朱曉杰等[9]、Nakamura等[10]的方法進行。用ACE 水解底物馬尿酰- 組氨酰- 亮氨酸(Hip - His - Leu,簡稱HHL)C 末端的二肽His-Leu,生成馬尿酸。使用高效液相色譜(HPLC)測定馬尿酸生成量,計算ACE 抑制率,從而推測是否具有降血壓活性。

    將海星乙醇粗提物、石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層樣品(以溶劑為溶質(zhì))分別配成濃度為100、50、25、12.5 mg/mL 的水溶液,以蒸餾水作為對照。用硼酸緩沖溶液將ACE 配成60 U/L 的酶溶液。取海星甾體化合物樣品10 μL 放入0.5 mL的離心管中,加入ACE 30 μL,37 ℃條件下反應(yīng)5 min 后,加入50 μL 底物溶液,37 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)30 min 后,加入10 μL 10%的三氟乙酸終止反應(yīng),得到反應(yīng)液[11]。用HPLC 測定反應(yīng)液中馬尿酸的生成量,A 液:用1000 mL 體積分數(shù)為30%的甲醇(含有1 mL 三氟乙酸及0.5 mL 冰乙酸),B液:用1000 mL 體積分數(shù)為70%的甲醇(含有1 mL 三氟乙酸及0.5 mL 冰乙酸),調(diào)A、B 液的pH為3.0 ~3.3,然后進行梯度洗脫,最后在波長為228 nm 下進行測定[11]。

    2 結(jié)果

    2.1 海星總甾體化合物的提取、分離

    本試驗中用70%的乙醇對海星進行熱浸提后,減壓濃縮,用等體積的石油醚萃取脫脂,再依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,獲得含大量甾體化合物的部分,剩余的水層部分主要為蛋白質(zhì)、糖等大分子物質(zhì)。利用展開劑[φ(氯仿)∶ φ(甲醇)∶ φ(水)=7∶ 3∶ 1]進行薄層層析,結(jié)果表明,不同溶劑提取物中均含甾體化合物,但乙酸乙酯和正丁醇溶劑中呈現(xiàn)的斑點較多(圖1)。

    圖1 海星甾體化合物粗品薄層層析圖Fig.1 The thin-layer chromatogram(TLC)of steroids in crude extracts from starfish

    近年來,已有學(xué)者進行了對海星中甾體化合物的分離研究,Ikegami等[12]從多棘海盤車中分離得到新甾體化合物6a - 羥基-3β - 磺酸- 氧化-5a-孕烷-9(11)-雙鍵-20 -羰基,Liu等[13]從正丁醇部分分離得到了6 個甾體硫酸鹽;Levina等[14]從遠東海星Henricia sanguinolenta和H.leviuscula leviuscula 中分離得到1 個新的三羥基甾酮化合物。本試驗中,由于乙酸乙酯層和正丁醇層含有未萃取完全的脂溶性物質(zhì),故采用正向硅膠柱色譜進行進一步分離。將正丁醇層經(jīng)過正向硅膠柱色譜后,按照其極性的大小,得到18 個溶劑。將其中的F 組分再次經(jīng)過正向硅膠柱層析和Sephadex LH-20 柱色譜,得到F1~F88 個亞組分,利用展開劑[φ(氯仿)∶ φ(甲醇)=9∶ 1]對甾體化合物F3進行薄層色譜分析,結(jié)果顯色后為單點(圖2)。

    圖2 甾體化合物F3 的TLC 檢測結(jié)果Fig.2 TLC of F3 steroid

    2.2 海星中甾體化合物的鑒定

    海星甾體化合物F3溶液出現(xiàn)了黃—紅—紫—綠的顏色變化,L -B 反應(yīng)為陽性,說明該化合物為甾體化合物。

    2.3 海星各溶劑中甾體化合物的含量

    以齊墩果酸標準品的吸光度(Y)為縱坐標,以標準品濃度(X)為橫坐標,制得標準曲線,回歸方程為Y=0.0024X -0.0225,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。根據(jù)標準曲線算出各溶劑中總甾體化合物的含量,其中,正丁醇層中總甾體化合物的含量最高,石油醚層中最低,僅為0.54 mg/g(圖3)。

    圖3 海星各溶劑中總甾體化合物的含量Fig.3 The contents of steroids in all extracts from starfish

    2.4 海星提取物對ACE 酶活性的抑制作用

    海星提取物對ACE 酶的抑制作用隨著樣品濃度的降低而降低。如圖4所示,海星乙醇粗提物、乙酸乙酯層和正丁醇層總甾體化合物對ACE 酶活性均具有明顯的抑制作用,而石油醚粗提物的抑制作用則較低;濃度為100 mg/mL 的正丁醇層溶液對ACE 酶的抑制率最高,為78.05%。

    圖4 海星各溶劑中總甾體化合物對ACE 活性的抑制率Fig.4 The inhibitory activity of starfish extracts for ACE

    半數(shù)抑制濃度(IC50)是指ACE 抑制率達到50%時的樣品濃度。通過SPSS 17.0 軟件分析可知:海星各溶劑中,石油醚層的IC50值最大,為182.71 mg/mL,說明石油醚層對ACE 的抑制效果不顯著;正丁醇層的IC50值最小,僅為27.76 mg/mL;乙醇粗提物IC50值為39.84 mg/mL,乙酸乙酯層IC50值為36.27 mg/mL。

    3 討論

    本試驗中,為篩選具有抑制ACE 活性的甾體化合物,通過正向硅膠柱層析、SephadexTMLH -20柱層析和薄層層析對海星中甾體化合物進行提取、分離純化。各溶劑中甾體化合物含量的測定結(jié)果和ACE 活性試驗結(jié)果表明,石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層甾體化合物的含量依次增大,而各溶劑對ACE 酶的抑制率也依次增大,因此可推斷,甾體化合物的含量可以影響ACE 酶的活性。

    近年來,由高血壓、高血脂引起的心腦血管疾病逐漸增多,高血壓、高血脂現(xiàn)已成為人類健康的一大殺手[15-16]。ACE 酶既可以分解有緩解血管緊張作用的舒緩激肽,又可以產(chǎn)生血管緊張素,從而使血壓上升,是高血壓蛋白酶- 血管緊縮素(RAS)系統(tǒng)最重要的調(diào)節(jié)因子。ACE 抑制劑(ACEI)具有使血管擴張、降低血壓的作用,從而改善糖代謝紊亂,是人們普遍使用的降血壓藥物,在治療高血壓的過程中發(fā)揮著一定的作用。從天然產(chǎn)物中得到的ACEI,作用溫和、毒性小,可多途徑、多靶點作用,因此,從海星中分離安全有效的降血壓成分具有重要的意義。

    海洋生物為適應(yīng)海洋環(huán)境而產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)是陸地生物所不能及的。海星甾體化合物有降血壓作用,它直接作用于血管系統(tǒng),不受迷走神經(jīng)分布的影響,非組織胺釋放的結(jié)果或?qū)Κ毩⒌摩?與β受體的作用,且與觸角的傳導(dǎo)和膽堿能作用無關(guān)。因此,海星甾體化合物可以作為降血壓藥物的有效成分,為新藥和保健品的研制提供參考。

    [1]Shahidi N T.A review of the chemistry,biological action and clinical applications of anabolic - androgenic steroids[J].Clin Ther,2001,23(9):1355 -1390.

    [2]Jacob S,Hayreh Davinder J S,McClintock M K.Context-dependent effects of steroid chemosignals on human physiology and mood[J].Physiol Behav,2001,74:15 -27.

    [3]李敏晶,韓艷玲,譚成玉,等.不同提取方法對海燕皂苷抗氧化活性的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2011,26(4):344 -347.

    [4]D'Auria M V,Minale L,Riccio R.Polyoxygenated steroids of marine origin[J].Chem Rev,1993,93:1839 -1895.

    [5]Cui J G,Wang Y,Lin C W,et al.Polyhydroxylated sterols with biological activities in marine organism[J].Nat Prod R&D,2000,12(6):94 -100.

    [6]Wang W H,Li F M,Jung J H,et al.Progress on the research of the chemical constitutes and activities from Asteroidea[J].Chin J Mar Drugs,2002,5:46 -50.

    [7]湯海峰,易楊華,姚新生.海洋甾體化合物的研究進展[J].中國海洋藥物,2002(2):42 -43.

    [8]韓艷玲,周月,李敏晶.用復(fù)合酶法提取海燕中總皂苷的工藝研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2009,24(3):206 -208.

    [9]朱曉杰,曾名湧,趙元暉,等.海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應(yīng)修飾及其對ACE 活性的影響[J].中國海洋藥物,2011,30(6):6 -12.

    [10]Nakamura Y,Masuda O,Takano T.Decrease of tissue angiotensin I-converting enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneous hypertensive rats[J].Biosci Biotechl Bioch,1996,60:488 -489.

    [11]趙元暉,李八方,劉藝杰,等.食源性ACE 抑制肽體外活性檢測方法的改進及應(yīng)用[J].中國海洋藥物,2009,28(4):5 -9.

    [12]Ikegami S,Kamiya Y,Tamura S.A new steroidal sulfated obtained from a starfish saponin,asterosaponin A[J].Tetrahedron Lett,1973(10):731 -734.

    [13]Liu H W,Li J K,Wang N L,et al.Sulfated sterols isolated from starfish Asterias amurensis Lutken[J].J Chi Pharm Sci,2006,15(1):1 -5.

    [14]Levina E V,Kalinovskii A I,Stonik V A,et al.Steroidal polyols from Far-Eastern starfishes Henricia sanguinolenta and H.leviuscula leviuscula[J].Bioorg Khim,2003,52(7):1623 -1628.

    [15]付慧,汪秋寬,何云海,等.多肋藻渣膳食纖維對小鼠降血脂作用的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2012,27(3):200 -204.

    [16]李鷥鷥,汪秋寬,何云海,等.多肋藻巖藻聚糖硫酸酯的提取及其降血脂作用研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2013,28(1):94 -98.

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