纈沙坦對人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中g(shù)p91Phox的影響

王 成，韓衛(wèi)星，吳繼軍，劉 超，劉曉穎

纈沙坦對人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中g(shù)p91Phox的影響

王 成1，2，韓衛(wèi)星1，吳繼軍1，劉 超3，劉曉穎4

目的研究纈沙坦對人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）氧化應(yīng)激過程中g(shù)p91Phox的影響。方法對照組：體外貼壁培養(yǎng)HCAEC，不進(jìn)行其他干預(yù)；實驗組：相同培養(yǎng)條件下加入纈沙坦（10 μmol／L）培養(yǎng)24 h。應(yīng)用Western blot法和細(xì)胞免疫熒光法測定兩組細(xì)胞中g(shù)p91Phox的水平，對兩組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析并比較。結(jié)果實驗組HCAEC中g(shù)p91Phox的水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論纈沙坦可以顯著減少HCAEC中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亞基gp91Phox的表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激水平。

纈沙坦；人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；gp91Phox

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）系統(tǒng)的氧化作用水平與具有阻止其效應(yīng)、修復(fù)其損害的抗氧化系統(tǒng)的抗氧化作用水平失衡。體內(nèi)的ROS產(chǎn)生過多或機體的抗氧化能力減低，致使ROS清除不完全，而在機體內(nèi)聚積，產(chǎn)生氧化性損傷［1－2］。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是體內(nèi)產(chǎn)生ROS的重要酶之一，是由細(xì)胞膜亞基gp91Phox、p22Phox，細(xì)胞漿亞基p40Phox、p47Phox、p67Phox以及小分子的GTP酶結(jié)合蛋白Rac組成的復(fù)合體［3］。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker，ARB）成為目前臨床治療心血管系統(tǒng)疾病的常用藥，可干擾NADPH氧化酶以降低氧化應(yīng)激水平。針對NADPH氧化酶所采用的抗氧化治療可能成為今后預(yù)防和治療與氧化應(yīng)激有關(guān)疾病的作用靶點［4］，從而也為心血管疾病的臨床抗氧化治療提供一個新途徑。然而ARB類藥物如何通過NADPH氧化酶來降低氧化應(yīng)激水平的具體途徑和機制尚不明確。該研究旨在探討ARB類藥物纈沙坦對人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）氧化應(yīng)激過程中NADPH氧化酶亞基gp91Phox的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HCAEC購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；纈沙坦購自美國Sigma公司；小鼠抗人多克隆抗體gp91Phox購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆抗體β-actin、TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒均購自美國Pierce公司；蛋白Marker購自北京全式金公司；DAPI購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代按常規(guī)方法操作。細(xì)胞以105密度傳代，傳代細(xì)胞隨機分兩組：一組作為對照組，對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；另一組作為實驗組，實驗組在細(xì)胞傳代2 h后，細(xì)胞基本貼壁時，加入纈沙坦（10 μmol／L）并記時，待處理24 h后，取出兩組培養(yǎng)的細(xì)胞備用。

1.2.2 蛋白樣品的提取 分別取出上述兩組細(xì)胞置于冰上，吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS液洗3次，再加1 ml預(yù)冷PBS吹打貼壁細(xì)胞，收集實驗組和對照組的細(xì)胞于EP管中，4℃離心2 min（4 000 r／min），分別加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，在冰水中超聲裂解細(xì)胞15 s，4℃離心10 min（4 000 r／min），分別收集上清液于新EP管中，4℃離心20 min（14 000 r／min），此時上清液即為細(xì)胞質(zhì)蛋白成分，沉淀部分用分析液溶解即為細(xì)胞膜蛋白成分。提取的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白，并用BCA試劑盒進(jìn)行定量，加入上樣緩沖液，放入煮沸的水浴鍋內(nèi)加熱5 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blot法測定細(xì)胞中g(shù)p91Phox的水平

取出上述的蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，5%濃縮膠以80 V電壓電泳約30 min，12%分離膠以100 V電壓電泳約120 min。完成后取出凝膠，以80 V電壓轉(zhuǎn)膜約60 min，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。取出PVDF膜，以5%脫脂奶溶液封閉2 h，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶500）于4℃孵育過夜。以TBST洗膜3次，每次10 min，洗滌后加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h，同時以β-actin（1∶1 000）作為內(nèi)參，最后用ECL發(fā)光試劑盒檢測，壓片曝光顯影。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光法測定細(xì)胞中g(shù)p91Phox的水平

細(xì)胞免疫熒光片的制作，常規(guī)傳代培養(yǎng)細(xì)胞，放入用多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片，2 h后待細(xì)胞基本貼壁時，實驗組加入纈沙坦（10 μmol／L），對照組不做任何處理，待24 h后取出蓋玻片，用PBS溶液洗3次，每次5 min，－20℃預(yù)冷的甲醛固定2 min，棄甲醛，70%乙醇室溫固定5 min，棄乙醇，PBS溶液洗3次，每次5 min。1%脫脂奶溶液封閉30 min，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶100）室溫孵育2 h。以封閉液洗洗3次，每次5 min，再以TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶200）作為二抗，室溫孵育1 h，PBS溶液洗3次，每次5 min，以0.5 μg／ml DAPI溶液100 μl覆蓋蓋玻片，室溫3 min，PBS溶液洗3次，每次5 min，用熒光封片膠封片，4℃避光儲存，隔夜后于熒光顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測纈沙坦對HCAEC中g(shù)p91Phox表達(dá)水平的影響與對照組比較，實驗組在HCAEC中g(shù)p91Phox表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 細(xì)胞免疫熒光法觀察纈沙坦對HCAEC中g(shù)p91Phox表達(dá)水平的影響采用細(xì)胞免疫熒光方法觀察結(jié)果如下：與對照組比較，實驗組在HCAEC中g(shù)p91Phox表達(dá)水平顯著降低，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察纈沙坦對HCAEC中g(shù)p91Phox蛋白表達(dá)的影響 ×1 000A、B、C：對照組；D、E、F：實驗組；1：DAPI染色示細(xì)胞核；2：TRITC標(biāo)記gp91Phox蛋白；3：MERGE為相應(yīng)組1和2兩個圖像的疊加

3 討論

冠心病已成為目前心血管疾病中導(dǎo)致猝死的主要原因之一，其發(fā)病原因已經(jīng)不能完全用那些傳統(tǒng)危險因素加以解釋，如吸煙、糖尿病、高血壓和高血脂等。氧化應(yīng)激作為一個新的角色，在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用。氧化應(yīng)激時機體內(nèi)各種有害刺激導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，而抗氧化防御與其嚴(yán)重失衡，致使ROS積蓄，從而引起細(xì)胞毒性反應(yīng)和組織損傷［5］。當(dāng)ROS生成過多而抗氧化酶活性不足時，就會引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等的氧化性損傷，造成細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)生障礙，從而引起相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展［6］。

氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的眾多危險因素以及分子水平損傷機制里都有其參與［7］。研究［8］表明ROS不僅存在于動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，而且病程進(jìn)展中也一直有ROS的存在。冠狀動脈斑塊的形成以及破裂與ROS的氧化性損傷作用有關(guān)，其可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，從而引起多種細(xì)胞因子產(chǎn)生及活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡以及血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生遷移，最終引起冠狀動脈內(nèi)斑塊的形成以及破裂。Honjo et al［9］研究發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈粥樣硬化患者的冠脈中NADPH氧化酶的表達(dá)顯著增強，并且脈管中被氧化的低密度脂蛋白的分布也與NADPH氧化酶以及ROS有著密切的聯(lián)系，氧化型低密度脂蛋白是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)促炎癥因子表達(dá)的重要原因，脈管中的NADPH氧化酶、ROS以及低密度脂蛋白形成了一個惡性循環(huán)。

動脈粥樣硬化是冠心病發(fā)病的基礎(chǔ)，而動脈粥樣硬化是一種由于氧化應(yīng)激引起和放大的血管壁的炎性反應(yīng)，而ARB類藥物可以降低氧化應(yīng)激水平［10］。內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化發(fā)生的第一步，腎素－血管緊張素系統(tǒng)在發(fā)展內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化中扮演重要的角色，許多臨床試驗［11］顯示ARB類藥物能減少心血管疾病的發(fā)生，表明ARB類藥物能預(yù)防和延遲動脈粥樣硬化。臨床中運用ARB類與他汀類藥物聯(lián)合用藥治療心血管系統(tǒng)疾病，可以更好的降低組織的氧化應(yīng)激水平，比兩者單獨使用更加有效［12］。氧化應(yīng)激在眾多的心血管疾病尤其是在冠心病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，傳統(tǒng)治療方法療效始終有限，而介入支架治療創(chuàng)傷性較大且治標(biāo)不治本，容易二次堵塞，因此在傳統(tǒng)治療方法上聯(lián)合抗氧化治療已成為一種趨勢，而ARB類藥物也成為目前臨床首選的抗氧化治療藥物之一。雖然目前臨床抗氧化治療冠心病尚未取得預(yù)期的療效，但隨著對氧化應(yīng)激研究的不斷深入，新型抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)，冠心病的治療定會取得滿意療效。

鑒于ARB類藥物對NADPH氧化酶的影響，本實驗研究了ARB類藥物對NADPH氧化酶亞基gp91Phox的影響，并表明纈沙坦可以抑制HCAEC的NADPH氧化酶亞基gp91Phox的表達(dá)，纈沙坦可以抑制血管的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示可能是ARB類藥物能夠降低氧化應(yīng)激水平的機制之一；同時，也說明纈沙坦對冠狀動脈氧化應(yīng)激狀態(tài)有抑制作用，應(yīng)該對冠心病的防治有益。但ARB類藥物對NADPH氧化酶的其他亞基影響及作用機制，將是本實驗室接下來需要研究的。

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Effect on gp91Phoxhuman coronary artery endothelial cells in the process of oxidative stress by valsartan

Wang Cheng1，2，Han Weixing1，Wu Jijun1，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Diagnostics，The First Clinical College of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study the effect on human coronary artery endothelial cells（HCAEC）gp91Phoxin the process of oxidative stress by valsartan.MethodsThe control group：adherent culture HCAEC in vitro，no other intervention；the experimental group：under the same conditions with valsartan（10 μmol／L）train for 24 hours.U-sing Western blot and cell immunofluorescence measure gp91Phoxlevels in two groups of cells.The results were statistically analyzed and compared in both groups.ResultsThe experimental group gp91Phoxlevel significantly lower than the control group in HCAEC（P＜0.01），the difference was statistically significant.ConclusionValsartan can significantly decrease the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase subunit gp91Phoxexpression in HCAEC，thus reduce oxidative stress level.

valsartan；HCAEC；oxidative stress；gp91Phox

R 541.4；R 972＋.4

A

1000－1492（2014）06－0739－04

2014－02－17接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81070210）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022安徽醫(yī)科大學(xué)2第一臨床學(xué)院診斷學(xué)教研室、3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室、4生命科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，合肥 230032

王 成，男，碩士研究生；韓衛(wèi)星，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayhwx57＠163.com