葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的Candida tropicalis過量表達及其對木糖醇合成代謝的影響

高雪楠，張 嬋,，尹 勝，張秋晨，王成濤,,，徐寶財,

（1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

木糖醇是甜度最高的糖醇，其甜度相當于蔗糖，熱量只有蔗糖的40%，并具有清涼感，因其具有防齲齒、潔齒、潤喉、改善胃腸功能等特點，已廣泛應用于口香糖、膠姆糖、太妃糖、軟糖、巧克力、果凍、冷飲、口含片、漱口劑、潤喉藥物、止咳糖漿中；木糖醇代謝不需要胰島素調節(jié)，不會導致人體血糖的劇烈變化，可作為糖尿病人的甜味劑；木糖醇可促進肝糖元合成，減少脂肪和肝組織中蛋白質消耗，具有改善肝功能和抗脂肪肝的作用，可作為肝炎、高血壓、高血脂和年老體弱病人的專用輸液劑。近年來，隨著人們生活質量提高，木糖醇的健康功效越來越多被消費者所接受[1-3]。全球木糖醇年需求量10萬t以上，我是世界木糖醇的主要生產(chǎn)和出口國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量約40%，我國木糖醇年需求量2.5萬t以上。目前木糖醇主要通過化學合成制造，需使用有毒性的鎳催化劑和高壓氫氣，要求原料木糖的純度高，工藝復雜、安全性差、生產(chǎn)成本高、副產(chǎn)物成分復雜，環(huán)境污染嚴重，不符合節(jié)能減排、可持續(xù)發(fā)展的社會要求，成為目前國家嚴格限制發(fā)展的行業(yè)[4]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌可轉化木糖生成木糖醇，該生化過程的原料木糖無需純化制備，反應條件溫和，無需耐高壓設備，此“清潔”、“綠色”的生產(chǎn)技術成為近年研究熱點[5-7]。木糖醇的生物合成與磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)緊密相連，需要木糖還原酶、還原性輔酶NADPH等參與（木糖＋，此還原反應是木糖醇能否順利連續(xù)合成的關鍵步驟[8-10]，NADPH主要是通過PPP途徑產(chǎn)生，當PPP途徑受到破壞，木糖醇產(chǎn)量則明顯降低[11]。關于增強PPP途徑的代謝通量分配及NADPH的再生，改善PPP途徑以提高木糖醇產(chǎn)率的研究已有一些報道[12-19]。Kang等[15]研究認為，以木糖為底物發(fā)酵時，PPP途徑的多種酶活力遠遠高于以葡萄糖為底物時的情況。Choi等[16]研究認為，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose 6-phosphatedehydrogenase，G6PDH）是PPP途徑中催化生成NADPH的關鍵性調控限速酶，因此，提高G6PDH的酶活力是增加NADPH供應量的有效手段之一。Kwon等[17]將Saccharomyces cerevisiae的G6PDH編碼基因ZWF1導入遺傳改造后含外源木糖脫氫酶基因的釀酒酵母中，改造后重組菌株中G6PDH的酶活力提高了近6倍，發(fā)酵液中木糖醇濃度與只導入木糖脫氫酶基因的菌株相比，木糖醇產(chǎn)率提高了25%，表明導入編碼G6PDH的基因能夠顯著提高木糖醇產(chǎn)率。熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）也是目前木糖醇生產(chǎn)研究廣泛應用的菌株[6-7,15-16]。本實驗以Candida tropicalisCT16為模式菌株，將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因G6PDH進行克隆、過量表達，構建高產(chǎn)穩(wěn)定表達的木糖醇工程菌株，研究其對木糖醇合成代謝的影響，為木糖醇生物合成制造提供優(yōu)良菌株和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C.tropicalisCT16 本實驗室保存；Escherichia coliTOP10感受態(tài)細胞 天根生化科技（北京）有限公司；酵母表達載體pYES-pgk 本實驗室構建保存。

酵母基因組提取試劑盒、酵母質粒提取試劑盒、抗生素G418 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker北京全式金公司；EXTaqDNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨和蛋白胨英國Oxoid公司；木糖山東福田科技集團；木糖醇（分析純）美國Sigma公司；NADP+、NADPH 半夏科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani （LB）培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物5、NaCl 10；YPD （yeast extract peptone dextrose）培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物10；木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木糖100、葡萄糖10、蛋白胨 1、酵母提取物0.5。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中報道的C.tropicalis葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd編碼序列（Accession No.XM_002548907），利用DNAMAN軟件設計引物。

g6pd基因擴增引物：F-g6pd：5’-GG GGT ACC ATG TCT TAT GAT TCA TTC GG-3’（酶切位點KpnⅠ）；R-g6pd：5’-GC TCT AGA TTA GAT CTT ACC TTT GAC AT-3’（酶切位點XbaⅠ）。酵母轉化子鑒定引物：F-T7：5’-CAG CTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’；R-CYC1：5’-TATAATACCGGTGTTGGCCGATTCATTATT-3’。

1.4 g6pd基因的PCR擴增

以C.tropicalisCT16的基因組為模板，設計引物F-g6pd和R-g6pd進行PCR擴增。反應體系如下：ExTaq聚合酶0.3 μL、模板2 μL、上下游引物（10 mmol/L）各1 μL、dNTP混合物（2.5 mmol/L）2 μL、10×Ex TaqBuffer 2.5 μL、ddH2O補至25 μL。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min。凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工（生物）工程技術有限公司測序，DNAMAN軟件和NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站在線BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列分析和同源性搜索比對。

1.5 表達載體pYES-pgk-g6pd的構建

表達載體pYES-pgk-g6pd的構建如圖1所示。KpnⅠ和XbaⅠ分別對g6pd基因片段和pYES-pgk進行雙酶切，純化回收的酶切片斷經(jīng)T4 DNA Ligase于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉化E.coliTOP10感受態(tài)細胞，在添加抗生素G418的LB平板上篩選陽性重組子，37℃培養(yǎng)過夜，提取陽性菌落質粒鑒定。

圖1 表達載體pYES-pgk-g6pd的構建策略Fig.1 Construction strategy of the expression vector pYES-pgk-g6pd

1.6 g6pd基因在C.tropicalis中的過量表達

利用LiAc/ssDNA/PEG方法將重組表達載體pYES-pgk-g6pd轉化至C.tropicalisCT16感受態(tài)細胞中，在添加G418的YPD平板上篩選陽性重組子。提取重組子質粒，設計引物F-T7和R-CYC1進行PCR擴增，回收目的條帶，酶切、測序鑒定重組子。C.tropicalis感受態(tài)細胞的制備及其轉化方法參照文獻[20]。

1.7 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）的酶活力檢測

取30 h的發(fā)酵液，1 100 r/min、4℃離心20 min，滅菌蒸餾水洗滌、重懸、再離心，菌體重懸于緩沖液體系：10 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 mmol/L甘氨酸、0.071 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），并加入玻璃珠（體積比1∶1）振蕩破碎，離心取上清液（粗酶液）用于酶活力分析[13]。

反應體系（2.56 mL）：2 mL 70 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.4 mL 35 mmol/L MgCl2、20 μL 131 mmol/L NADP+、40μL 500 mmol/L 6-磷酸-葡萄糖、0.1 mL粗酶液。30 ℃、340 nm測定NADPH吸收值變化。340 nm波長處每隔30 s測定一次吸光度，反應10 min，以吸光度y與NADPH濃度x（mmol/L）作標準曲線。G6PDH酶活力定義：反應體系中每分鐘還原1 μL NADP+所需的酶量為1U。

1.8 發(fā)酵實驗及木糖和木糖醇的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測

將C.tropicalisCT16野生型和重組菌株C.tropicalisSYG5 以3%的接種量分別接種到木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔10 h取發(fā)酵液樣品，8 000 r/min離心4 min，HPLC檢測木糖及木糖醇濃度。HPLC（島津LC-20A）檢測條件為：色譜柱HPX-87H（300 mm×7.8 mm），示差折光檢測器，柱溫45 ℃，流動相0.5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd的PCR擴增

以C.tropicalisCT16基因組為模板，擴增目的基因片段，電泳、測序。如圖2所示，得到的PCR產(chǎn)物單一DNA片段大小約為1.5 kb，與預期相符。將純化的PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)DNAMAN軟件和NCBI比對，與GenBank中報道的C.tropicalis基因g6pd（Accession No.XM_002548907）相似度達100%，表明g6pd基因擴增正確。

圖2 g6pd基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene

2.2 表達載體pYES-pgk-g6pd的構建

使用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定重組質粒，電泳檢測如圖3所示。重組質粒pYES-pgk-g6pd經(jīng)雙酶切得到6.0 kb和1.5 kb的清晰條帶，與預期相符，證明表達載體構建正確。

圖3 KKppnnⅠ+XbaⅠ雙酶切重組質粒pYES-pgk-g6pd電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the plasmid pYES-pgk-g6pd double digested with KpnⅠ+ XbaⅠ

2.3 重組C.tropicalis的篩選、鑒定及酶活力分析

表達載體pYES-pgk-g6pd轉入C.tropicalisCT16后，在含抗生素G418的YPD平板上進行篩選。從平板上挑取長勢較好的單菌落，在含1 mg/mL G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選獲得陽性轉化子C.tropicalisSYG5。

提取C.tropicalisSYG5質粒，設計引物F-T7和R-CYC1-Age PCR擴增，電泳檢測結果如圖4所示。從轉化子（工程菌）SYG5中擴增g6pd基因表達盒（包括啟動子、g6pd基因編碼序列和終止子）的特異性條帶，大小約為1.9 kb，與預期相符，且測序驗證正確，表明重組質粒pYES-pgk-g6pd已轉入C.tropicalisCT16。

分析30 h發(fā)酵粗酶液的G6PDH酶活力，以吸光度y與NADPH濃度x（mmol/L）作標準曲線，獲得方程y=0.005 5x－0.007 3（R2＝0.999 9）。C.tropicalisCT16 G6PDH的酶活力為786 U/L，C.tropicalisSYG5的G6PDH酶活力為3 145 U/L，說明g6pd基因的過量表達能顯著增強C.tropicalisG6PDH的活性。

圖4 重組菌株C.tropicaalis SYG5中g6pd基因表達盒的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of the g6pd gene expression cassette from the recombinant strain C.tropicalis SYG5

2.4 野生菌和工程菌轉化木糖醇能力比較

將野生型菌C.tropicalisCT16和重組工程菌C.tropicalisSYG5分別接種于木糖醇發(fā)酵培養(yǎng)液。如圖5所示，在此實驗條件下發(fā)酵液中木糖和木糖醇能較好的分離，且峰型較好，無前延、拖尾、重疊，其木糖和木糖醇的特征峰分別出現(xiàn)于11.354 min和13.161 min。

圖5 木糖和木糖醇的HPLC分析Fig.5 HPLC analysis of xylose and xylitol

如圖6所示，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇生成量隨發(fā)酵時間延長逐漸增多，搖瓶發(fā)酵62 h時木糖醇質量濃度達到最高值79.90 g/L，木糖醇產(chǎn)率為1.29 g/（L·h）；野生菌株CT16發(fā)酵80 h時，木糖醇生成量達到峰值，約為71.08 g/L，產(chǎn)率為0.89 g/（L·h）。與野生型菌株相比，工程菌C.tropicalisSYG5的木糖醇產(chǎn)量提高12.41%，產(chǎn)率提高44.94%。發(fā)酵62 h時，工程菌SYG5的木糖幾乎完全消耗，木糖醇呈現(xiàn)最高質量濃度，隨后木糖醇消耗，導致其質量濃度下降；野生菌C.tropicalisCT16發(fā)酵80 h時木糖醇濃度才達到最大值，但其峰值明顯低于工程菌SYG5。上述結果表明，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd的過量表達，可以顯著提高C.tropicalis的PPP途徑的G6PDH酶活力、代謝通量分配，增加NADPH供應量，加速木糖醇合成速率和產(chǎn)量，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在木糖醇生物合成過程中發(fā)揮關鍵性作用。

圖6 C.tropicalis CT16與C.tropicalis SYG5搖瓶發(fā)酵實驗中的木糖和木糖醇質量濃度動態(tài)變化曲線Fig.6 Dynamic curves of xylitol production and xylose consumption in C.tropicalis CT16 and C.tropicalis SYG5 during fermentation on xylose and glucose in shaking flasks

3 結 論

本實驗構建了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶g6pd基因的重組表達載體pYES-pgk-g6pd，并將其過量表達于C.tropicalisCT16，探索g6pd基因過量表達對木糖醇合成代謝影響。結果表明，發(fā)酵62 h時，攜帶重組質粒pYES-pgk-g6pd的工程菌C.TropicalisSYG5搖瓶發(fā)酵木糖醇產(chǎn)量為79.90 g/L，與野生菌株相比，木糖醇產(chǎn)量提高12.41%，產(chǎn)率提高44.94%；g6pd基因的過量表達，增強了G6PDH的酶活力，提高了菌體NADPH供應量和還原力，顯著促進木糖醇生物合成的代謝流量分配，提高了木糖醇產(chǎn)量和木糖產(chǎn)率。因此，G6PDH是木糖醇生物合成途徑中的關鍵酶，構建的高產(chǎn)木糖醇工程菌為其產(chǎn)業(yè)化轉化提供了重要基礎。

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