食物過敏原重組蛋白的研究進(jìn)展

孟軒夷，李 欣，高金燕，陳紅兵,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047）

食物過敏原重組蛋白的研究進(jìn)展

孟軒夷1,2，李 欣1,3，高金燕1,3，陳紅兵1,2,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047）

食物過敏原蛋白單一組分的品質(zhì)是制約食物過敏研究的關(guān)鍵因素之一。通過大腸桿菌、酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出的過敏原重組蛋白，具有產(chǎn)量高、純度高、均一性好等優(yōu)點，已在過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、食物過敏原的檢測、低致敏性蛋白的生產(chǎn)以及其他基礎(chǔ)研究等方面得到了具體的應(yīng)用。食物過敏原重組蛋白作為天然過敏原提取物的替代物顯示了巨大的發(fā)展?jié)摿?。總之，DNA重組技術(shù)是制備高品質(zhì)過敏原蛋白的一條嶄新途徑。

食物過敏原；基因表達(dá)系統(tǒng)；重組蛋白

食物過敏是指人體攝入食物中某種成分，即變應(yīng)原或過敏原后，機(jī)體對之產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體生理功能的紊亂和/或組織損傷，進(jìn)而引發(fā)的一系列臨床癥狀。近年來，全球食物過敏的發(fā)生率已呈上升趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重地影響了部分人群的生活質(zhì)量甚至危及生命[1]。據(jù)報道，170多種食物能夠引起過敏反應(yīng)，其中，90%以上過敏反應(yīng)是由八大類高致敏性食物引起，包括牛乳、蛋類、花生、大豆、小麥、堅果、魚和水生貝殼類動物[2]。因此，對高致敏性食物過敏原的研究迫在眉睫。

目前在食物過敏原研究中用到的主要是天然過敏原的提取物，然而天然提取物存在許多不能克服的缺點[3]。首先，在提取過程中，致敏組分與非致敏組分同時存在，導(dǎo)致提取物中組分復(fù)雜，難以制備高純度的單一過敏原；第二，許多 實驗表明[4]，提取物中引起過敏癥狀的致敏原不僅含量不足，而且含量、生物學(xué)活性因廠家、批次不同，致使過敏原很難標(biāo)準(zhǔn)化、不具有可比性[5-6]，不僅不利于食物過敏原的檢測，也很難找到與特異性IgE抗體相對應(yīng)的過敏原[7-8]；第三，天然過敏原提取物在加工提取和貯藏的過程中，其中固有的酶也能導(dǎo)致蛋白降解，導(dǎo)致其生物學(xué)活性降低。

相比之下，通過重組技術(shù)獲得食物過敏原重組蛋白是一條嶄新的途徑，它避免了天然過敏原提取物中的諸多不足。食物過敏原重組蛋白具有分子質(zhì)量確定、質(zhì)量穩(wěn)定、純度高以及產(chǎn)量高等優(yōu)點，而且其理化性質(zhì)和免疫學(xué)特性與天然過敏原相似，可以作為天然過敏原提取物的替代品用于食物過敏原的研究[9]。不僅如此，通過基因工程方法還可以對食物過敏原中的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定的修飾，從而達(dá)到降低致敏性的目的[10]。目前研究者已在八大類高致敏性食物過敏原蛋白中進(jìn)行了嘗試，并取得有效的成果。

1 食物過敏原重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)

目前通過DNA重組技術(shù)表達(dá)蛋白已成為一種常規(guī)方法，不同蛋白在不同系統(tǒng)中表達(dá)水平有顯著的差異，生產(chǎn)食物過敏原重組蛋白的主要表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)。

1.1 大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)[11]。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)條件簡單、生長繁殖快、基因操作容易、表達(dá)異源蛋白周期短、價格低廉以及可以快速生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點，也是最早應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)的菌株。該系統(tǒng)在生產(chǎn)花生、大豆、魚蝦等多種高致敏性食物過敏原重組蛋白中已有很 大的進(jìn)展。如，Kleber-Janker等[12]采用改良后的BL21（DE3）E.coli細(xì)胞（BL21-CodonPlus（DE3） -RIL），制備了花生主要過敏原Ara h 2，產(chǎn)率達(dá)到30 mg/L，比在傳統(tǒng)細(xì)胞BL21（DE3）E.coli中的表達(dá)量高100倍以上；Liu Bin等[13]將大豆過敏原蛋白P34（Gly m Bd 30 K）基因成功地在E.coliBL21（DE3）中表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)到12 μg/mg；Myrset等[14]將北歐蝦主要過敏原Pan b 1（原肌球蛋白）在E.coli RosettaTM2（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)量比之前Albrecht等[15]報道的表達(dá)量（5 mg/L）高80倍。

雖然大腸桿菌應(yīng)用廣泛，然而大腸桿菌還存在一些局限性，無法對表達(dá)蛋白進(jìn)行正確折疊和糖基化、磷酸化及酰基化修飾；且存在重組蛋白不能有效分泌到胞外，常常在胞內(nèi)形成不溶性包涵體等缺點[16]。

1.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母菌是一種單細(xì)胞的低等真核生物，能夠完成翻譯后的修飾，包括信號序列的處理、折疊加工、二硫鍵的形成以及脂肪和碳水化合物的添加[17]。與大腸桿菌相比，酵母菌可以對異源蛋白進(jìn)行糖基化修飾，表達(dá)需要糖基化的蛋白[18]。而且酵母具有安全可靠、生長迅速、培養(yǎng)周期短、操作簡單等優(yōu)點，已成為真核生物表達(dá)系統(tǒng)中最為普遍的一種[19]。酵母主要包括釀酒酵母和畢赤酵母，其中畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是最常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能使原本在胞內(nèi)形成不溶性包涵體的重組蛋白以可溶性形式表達(dá)，而且還可以克服異源蛋白降解問題[17]。

據(jù)報道，已有超過200種外源蛋白成功地在畢赤酵母中得到表達(dá)[20-21]。如，Kim等[22]用畢赤酵母高效表達(dá)了牛乳中高致敏性過敏原β-乳球蛋白，其產(chǎn)量超過1 g/L；Diaz-Perales等[23]在畢赤酵母中表達(dá)了桃的主要過敏原Pru p 3，通過圓二色譜分析，重組Pru p 3的蛋白折疊結(jié)構(gòu)與天然Pru p 3相同，說明了酵母能對外源蛋白進(jìn)行正確的折疊。此外，Cregg實驗室1993年就建立起了通過畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的網(wǎng)站[24]。由于畢赤酵母能夠?qū)^敏原重組蛋白進(jìn)行正確的折疊，且能保持與天然蛋白相同的結(jié)構(gòu)，為過敏原致敏性的研究提供了正確的表位，因此，研究畢赤酵母對食物過敏原重組蛋白的表達(dá)有重要的發(fā)展意義。

2 食物過敏原重組蛋白的應(yīng)用

目前通過大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的重組 蛋白已經(jīng)在過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、食物過敏原的檢測以及低致敏性蛋白的制備等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1 制備過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物

眾所周知，由于缺乏統(tǒng)一的食物過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使得對過敏原成分的定性、定量檢測結(jié)果無法溯源到一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此給食物過敏原蛋白的檢測造成極大障礙。因此，通過基因工程的手段生產(chǎn)過敏原重組蛋白是制備食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的重要途徑。

如，Himly等[25]通過SDS-PAGE、等電點聚焦以及脫酰胺基對制備的重組樺樹花粉過敏原Bet v 1.0101 Y0487進(jìn)行分析，表明該重組蛋白的均一性大于99.9%；通過人血清IgE ELISA顯示Y0487與天然Bet v 1的IC50一致；通過IgE和IgG免疫印跡發(fā)現(xiàn)Y0487與天然Bet v 1在誘導(dǎo)嗜堿性細(xì)胞和T細(xì)胞活化方面具有相同的作用。以上說明重組Bet v 1.0101 Y0487具有穩(wěn)定性高、免疫活性和單體結(jié)構(gòu)與天然Bet v 1相同的優(yōu)點，可以作為標(biāo)準(zhǔn)Bet v 1的候選物。盡管有成功的研究，但目前國內(nèi)外對于食物過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究尚處起步階段，其中標(biāo)準(zhǔn)化的重組過敏原種類不多。如，由歐盟資助的CREATE項目僅僅確定了3種重組過敏原（rBet v 1、rPhl p 5a和rDer p 2）可以作為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。但早期的研究工作為以后食物過敏原重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的研究奠定了基礎(chǔ)，提供了有利的借鑒作用[26-27]。因此，繼續(xù)通過分子克隆技術(shù)得到食物重組過敏原，與天然過敏原進(jìn)行比對成為候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)而作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究具有很大的發(fā)展意義[28]。

2.2 食物過敏原的檢測

食物過敏原重組蛋白具有產(chǎn)量高、純度高、性質(zhì)穩(wěn)定、均一性好等優(yōu)點。因此，利用重組蛋白制備單（多）克隆抗體可提高食物過敏原檢測的靈敏性與特異性[29]。利用此技術(shù)在大豆過敏原檢測方面最為常見，如鄒菊等[30]以大豆主要過敏原重組蛋 白P34（Gly m Bd 30K）為抗原，制備單克隆抗體，并建立雙單抗夾心ELISA檢測方法，該方法的檢出限為4 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線在4～125 μg/L的線性良好范圍內(nèi)。之后，Liu Bin等[13]通過重組表達(dá)過敏原P34制備多克隆抗體（pAB-P34），利用iELISA法檢測出大豆種子和豆粕中P34含量分別為4.62 μg/mg和3.91 μg/mg，且P34重組蛋白重復(fù)實驗變差系數(shù)少于7.77%，說明iELISA法具有很高的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。因此，基于重組蛋白P34制備的單（多）克隆抗體可以對不同大豆品種中主要過敏原P34進(jìn)行檢測。

另外，最近幾年蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展很快，具有高通量、檢測靈敏、樣品用量少等特點，顯示了在過敏原檢測方面的優(yōu)越性。如，Lin Jing等[31]通過合成含有牛乳主要過敏原表位的蛋白芯片，建立了運用蛋白芯片技術(shù)對牛乳過敏原表位進(jìn)行定位的方法。該技術(shù)不僅重現(xiàn)性與靈敏性較好，而且可以縮短檢測時間，還能同時檢測出多種過敏原[32]。如，Bublin等[33]利用重組蛋白建立檢測獼猴桃中過敏原的蛋白芯片方法，檢測結(jié)果顯示獼猴桃過敏陽性血清IgE抗體能夠檢測到單一的抗原，包括Act d 1、Act d 9、Act d 7，且陽性檢測率分別為45%、27%、13%。

2.3 制備低致敏性的食物過敏原

日常生活中，人們經(jīng)常食用花生、蕎麥、果蔬等多種過敏 原，對食物過敏的人群在實踐中很難完全避免與食物過敏 原的接觸。然而天然過敏原具有較強(qiáng)的致敏性，在治療過程中存在一定的危險性。因此運用重組技術(shù)制備低致敏性的食物過敏原重組蛋白具有重要的意義，為過敏反應(yīng)的臨床治療提供了前提條件。

目前，在制備過敏原重組蛋白過程中，通過基因突變制備低致敏蛋白是一種全新的策略，將其分子中的IgE結(jié)合表位通過定點突變誘導(dǎo)的方法進(jìn)行修飾，使其致敏性降低或消失。如，Bannon等[34]通過對花生過敏原（Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3）的IgE結(jié)合表位 進(jìn)行定點突變得到重組的花生過敏原蛋白，經(jīng)過免疫印跡分析，rAra h 1、rAra h 2和rAra h 3的IgE結(jié)合能力分別降低了35%、71%和41%。Yang Zhenhuang等[35]則利用定點誘變技術(shù)得到苦蕎麥主要過敏原Fag t 1的3個重組產(chǎn)物（Fag t 1-rs1、Fag t 1-rs2和Fag t 1-rs3），通過iELISA法分析，F(xiàn)ag t 1與天然Fag t 1相比，其IgE結(jié)合能力非常弱（P＜0.001）；與rFag t 1相比，其免疫活性至少降低90%。Tordesillas等[36]發(fā)現(xiàn)香瓜中主要過敏原Cuc m 2中一個構(gòu)象性表位可與許多花粉抑制蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，通過定點 誘變該特異性Cuc m 2表位中丙氨酸，得到2個突變體（Mut 1和Mut 2）。經(jīng)過BAT（嗜堿細(xì)胞活化實驗）和SPT（皮膚點刺）實驗發(fā)現(xiàn)，Mut 1比天然Cuc m 2的IgE結(jié)合能力低，而且其免疫活性與rCuc m 2很相似；而Mut 2的IgE結(jié)合能力降低為原來的57%，而且Mut 2和rCuc m 2在誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子方面具有相同的作用。Bolhaar等[37]對蘋果主要過敏原Mal d 1中的5個位點（T10PI30V、T57N、T112C和 I113V）進(jìn)行突變，得到低致敏性rMal d 1的突變體，通過RAST分析顯示，rMal d 1mut的IgE活性比野生型分子的活性降低了1/2，同時SPT和BHR分析rMal d 1mut的生物學(xué)活性降低幅度為1/2～1/200。

近幾年通過重組技術(shù)制備低致敏性食物過敏原的種類日益增加，這些過敏原主要作為特異性免疫治療的替代品[38]。為了更大程度地提升特異性免疫治療的安全性和療效，利用低致敏性食物過敏原制備的免疫疫苗將是未來有效治療食物過敏反應(yīng)的發(fā)展方向[39]。

2.4 其他應(yīng)用

食物過敏原重組蛋 白的應(yīng)用很多，不僅僅局限于以上所介紹的方面。利用重組技術(shù)定位過敏原蛋白的表位就是一個重要的研究方向，已在堅果、蝦、水果等多種食物過敏原方面得到廣泛應(yīng)用。如，Sharma等[40]通過重組山核桃主要過敏原Car i 4發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白的酸性亞基序列的強(qiáng)活性肽處于3個獨立的表位區(qū)域（118～132，208～219，238～249）；Reese等[41]對蝦主要過敏原Pen a 1中8個主要IgE結(jié)合表位中的12個氨基酸進(jìn)行突變，得到重組蛋白VR-9/1，通過介質(zhì)釋放實驗表明，小鼠模型中VR-9/1過敏反應(yīng)的效價在小鼠IgE 抗體的主要結(jié)合表位處顯著降低；Rodriguez-perez等[42]以重組桃過敏原Pru p 3的2個亞型Pru p 4.01和Pru p 4.02為實驗材料，探索其與Bet v 2的交叉反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物食品和花粉過敏性抑制蛋白的相似程度大于70%。不僅如此，重組蛋白還可以很好地應(yīng)用在過敏原結(jié)構(gòu)研究中。如，Tatsumi 等[21]利用重組技術(shù)得到了β-乳球蛋白亞型A的3個特異性糖基化位點（D28N、D137N/A139S和P153A）的突變體，通過內(nèi)熒光、圓二色譜以及單克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附實驗分析表明，3個特異性糖基化位點由于被高甘露糖鏈位點所覆蓋，使得β-乳球蛋白亞型A的結(jié)構(gòu)沒有本質(zhì)上的破壞，展示了重組的3個糖基化突變體與野生型β-乳球蛋白有相同的β-折疊結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 語

過去10年通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的過敏原重組蛋白已得到應(yīng)用，很大程度上提高了我們對食物過敏原的認(rèn)識。通過基因表達(dá)系統(tǒng)得到的重組蛋白，具有高產(chǎn)量、高品質(zhì)以及均一的物理、化學(xué)和免疫學(xué)特性等優(yōu)點，可以很好地作為天然過敏原的替代物，用于解決食物過敏問題。

但是，不同的食物過敏原蛋白氨基酸組成結(jié)構(gòu)不一樣，并且具有不 同的線性表位和構(gòu)象性表位等特點，需要選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)來 滿足個性化需求。另外，科研、醫(yī)療和工業(yè)生產(chǎn)中需要大量過敏原蛋白，因此高產(chǎn)量表達(dá)并降低制備成本是過敏原重組蛋白需首要突破的兩個問題。

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Research Progress in Recombinant Proteins of Food Allergens

MENG Xuan-yi1,2, LI Xin1,3, GAO Jin-yan1,3, CHEN Hong-bing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nancha ng 330047, China)

The quality of single component of the food allergen protein plays a key role in food allergies research. Recombinant proteins prepared by E. coli or yeast exp ression system have a number of advantages, such as high efficiency, high purity, good homogeneity and so on, which have been applied in the preparation of reference material, allergen detection, the production of hypoallergenic protein and laboratory research. Recombinant food allergens used as the substitutes for natural allergen extracts have shown great potential to provide a new way to produce standard allergen proteins with high quality.

food allergens; gene expression system; recombinant protein

TS201.1

A

1002-6630（2014）07-0276-04

10.7506/spkx1002-6630-201407054

2013-04-24

國家國際科技合作專項（2013DFG31380）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102205）；

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（21162019）；2011年度高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（20113601110003）；

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室項目（SKLF-ZZA-201302；SKLF-ZZB-201302）

孟軒夷（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：mengxuanyilucky@163.com

*通信作者：陳紅兵（1967—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com