二甲雙胍對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞NF-κB、MCP-1、ICAM-1表達(dá)及合成的影響

顧俊菲，葉山東，汪 姍，孫文佳，胡圓圓

二甲雙胍對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞NF-κB、MCP-1、ICAM-1表達(dá)及合成的影響

顧俊菲，葉山東，汪 姍，孫文佳，胡圓圓

目的觀察二甲雙胍對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（MCs）核因子-κB（NF-κB）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)及合成的影響，探討其對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)MCs，隨機(jī)分為正常糖組（NG）、高糖組（HG）及高糖＋不同濃度二甲雙胍組（M1、M2、M3）。培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞及上清液，采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）法檢測(cè)細(xì)胞NF-κB、MCP-1及ICAM-1的mRNA含量；采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞NF-κBp65及ICAM-1蛋白表達(dá)水平；采用ELISA法檢測(cè)上清液中MCP-1蛋白濃度。結(jié)果①M(fèi)Cs可表達(dá)NF-κB、MCP-1 和ICAM-1；②與NG組比較，HG組MCs NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，NF-κBp65、ICAM-1及細(xì)胞上清液中MCP-1蛋白含量增高（P＜0.05）；③經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后，高糖培養(yǎng)的MCs NF-κB、MCP-1及ICAM-1表達(dá)合成顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論二甲雙胍可抑制MCs NF-κB、MCP-1和ICAM-1的表達(dá)及合成，該作用可能與其腎臟保護(hù)機(jī)制有關(guān)。

二甲雙胍；核因子-κB；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；細(xì)胞間黏附分子-1

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為糖尿病微血管并發(fā)癥，已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭最常見(jiàn)的病因，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，涉及代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變和遺傳易感性等。系膜細(xì)胞在維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用，并且參與了多種腎小球疾病的致病過(guò)程。二甲雙胍作為一線抗糖尿病藥物，可能通過(guò)多種途徑對(duì)糖尿病腎臟病變有著獨(dú)立于降糖作用之外的積極影響，部分機(jī)制可能與其抑制腎臟局部炎癥因子有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MCs），觀察高糖及二甲雙胍對(duì)MCs炎癥因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）水平的影響，探討其對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 MCs購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要藥物與試劑 二甲雙胍、預(yù)染Marker（美國(guó)Sigma公司）；低糖DMEM培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（杭州市四季青公司）；胰蛋白酶（美國(guó)GIBCO-BRL公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；Real-time PCR試劑及所用引物（大連TaKaRa公司）；ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒和ECL檢測(cè)液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗NF-κBp65多克隆抗體、兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；β-actin抗體（上海生工生物工程有限公司）；辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 系膜細(xì)胞培養(yǎng) MCs常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的低糖DMEM（Glu 5.6 mmol／L）培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵育箱中孵育，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)，換用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，使所有細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，隨后隨機(jī)分為5組觀察：①正常對(duì)照組（NG組）：DMEM培養(yǎng)液（Glu 5.6 mmol／L）；②高糖組（HG組）：DMEM培養(yǎng)液（Glu 25 mmol／L）；③二甲雙胍組（M組）分3個(gè)亞組，M1組：HG＋二甲雙胍（0.5 mmol／L）；M2組：HG＋二甲雙胍（1.0mmol／L）；M3組：HG＋二甲雙胍（2.0 mmol／L）。以上各組標(biāo)本培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞及上清液。每組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)重復(fù)6次。

1.3 Real-time PCR測(cè)定MCs中NF-κB、ICAM-1、MCP-1的mRNA表達(dá)TRIzol法提取細(xì)胞RNA，測(cè)定A260／A280值在1.8～2.0，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物分別進(jìn)行NF-κB、MCP-1及β-actin的擴(kuò)增。NF-κB上游引物序列：5′-GGCA CAGT CAAG GCTG AGAA TG-3′，下游：5′-ATG G TGGT GAAG ACGA CGCC AGTA-3′；MCP-1上游引物序列：5′-CAAG GTAA GGAG CATAGAGCCAAC-3′，下游：5′-GAGG AAAT AGGG GAGCA GGAA C-3′；ICAM-1上游引物序列：5′-GCCC GGAG GATC ACAA ACGA C-3′，下游：5′-CCTG GGGC TGGC ATGT AAGA GT-3′；β-actin上游引物序列：5′-GCCT TAGC CTGG ACCC ATAG T-3′，下游：5′-GACC ACCA ATCC ACAC AGA-3′。使用ABI7500型擴(kuò)增儀，20 μl反應(yīng)體系熒光染料法，95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min的熱循環(huán)40次；95℃15 s、60℃1 min及95℃15 s循環(huán)1次。內(nèi)參和目的片段分別同批擴(kuò)增，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用ΔΔCt法分析Ct值，2－ΔΔCt表示目的基因mRNA表達(dá)的拷貝數(shù)與β-actin拷貝數(shù)之比。

1.4 Western blot法測(cè)定MCs中NF-κBp65和ICAM-1水平使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白提取液加入上樣緩沖液，95℃水煮5 min，使蛋白變性。分別等量點(diǎn)樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），脫脂奶粉封閉，將一抗NF-κBp65（1∶1 000）、ICAM-1（1∶1 000）、β-actin （1∶1 000）置于4℃過(guò)夜，洗膜，二抗（1∶5 000）孵育，ECL化學(xué)發(fā)光，X線片顯影定影。底片用Quatity One軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值表示目的蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.5 MCs上清液中的MCP-1蛋白含量測(cè)定采用雙抗體夾心法檢測(cè)MCP-1蛋白含量，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間比較，采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；方差不齊性數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)）進(jìn)行組間比較，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)高糖刺激下MCs NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達(dá)的影響與NG組比較，HG 組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），M1、M2和M3組相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。與HG組比較，M1、M2和M3組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量皆顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Real-time PCR測(cè)定各組NF-κB、MCP-1、ICAM-1的mRNA表達(dá)

2.2 二甲雙胍對(duì)高糖刺激下MCs上清液中MCP-1蛋白合成的影響與NG組比較，HG組、M1組、M2組MCP-1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；M3組MCP-1水平輕度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組比較，M1、M2和M3組上清液MCP-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 二甲雙胍對(duì)高糖刺激下系膜細(xì)胞NF-κBp65、ICAM-1蛋白合成的影響與NG組比較，HG、M1、M2、M3組NF-κBp65、ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量皆顯著升高（P＜0.01），其中M1、M2和M3組呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。與HG組比較，其余各組NF-κBp65、ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)量皆明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖2 ELISA法測(cè)定各組上清液MCP-1蛋白水平

圖3 Western blot法測(cè)定各組NF-κBp65、ICAM-1蛋白水平

MCs是腎臟的固有細(xì)胞之一，在維持腎小球生理功能中發(fā)揮重要作用。當(dāng)炎癥等病理狀態(tài)時(shí)，MCs被激活增殖，細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡，使細(xì)胞外基質(zhì)堆積，通過(guò)自分泌或旁分泌擴(kuò)大細(xì)胞因子效應(yīng)，損傷的腎小球可發(fā)展為腎小球硬化［1］。DN 以MCs病變?yōu)樘卣?，突出表現(xiàn)為MCs增生肥大，細(xì)胞外基質(zhì)堆積。目前研究［2］顯示，其發(fā)病機(jī)制與高糖所致的糖基化、多元醇通路激活、蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)，其中炎癥狀態(tài)貫穿DN始終。DN患者和動(dòng)物DN模型皆發(fā)現(xiàn)腎臟存在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子和黏附分子活化。

NF-κB在核蛋白家族中，主要發(fā)揮生理作用的是p50／p65二聚體，在組織細(xì)胞中廣泛存在，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄。Schmid et al［3］通過(guò)人腎臟活檢發(fā)現(xiàn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路在糖尿病腎組織顯著上調(diào)。Tesch［4］發(fā)現(xiàn)高糖刺激下MCs高表達(dá)NF-κB，可促進(jìn)MCP-1合成。MCP-1在大鼠DN模型中表達(dá)增加，可介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞遷移，上調(diào)黏附分子和其他細(xì)胞因子表達(dá)。在MCP-1缺陷型1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿?。═2DM）動(dòng)物模型中，腎臟損傷程度皆有所降低。ICAM-1作為細(xì)胞表面糖蛋白，介導(dǎo)白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附，生理狀況下，系膜細(xì)胞僅少量表達(dá)。在高糖、高脂血癥、高胰島素血癥或前炎癥因子等的誘導(dǎo)下，ICAM-1可大量合成。有研究［5］表明，高糖可以通過(guò)PKC-NF-κB依賴(lài)途徑誘導(dǎo)大鼠MCs ICAM-1等細(xì)胞因子的表達(dá)，參與DN的發(fā)生。臨床研究［6］中T2DM患者體內(nèi)可溶型ICAM-1增加。Okada et al［7］將基因敲除的ICAM-1（－／－）鏈脲霉素（STZ）模型鼠較之ICAM-1（＋／＋）鼠，血肌酐、尿素氮大大降低，白蛋白尿減少、腎小球肥大及系膜基質(zhì)沉積減輕，同時(shí)腎小球中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、Ⅳ型膠原的表達(dá)受抑制，認(rèn)為ICAM-1及其誘導(dǎo)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞在DN的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Giunti et al［8］研究認(rèn)為高糖通過(guò)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）激活NF-κB，進(jìn)而上調(diào)MCP-1的表達(dá)，介導(dǎo)了系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。過(guò)度表達(dá)的MCP-1能夠激活單核細(xì)胞中的溶酶體酶及蛋白水解酶，促進(jìn)ROS釋放，引發(fā)氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)DN發(fā)生；MCP-1也可促進(jìn)ICAM-1等多種細(xì)胞因子合成和釋放，加劇單核巨噬細(xì)胞在腎組織浸潤(rùn)及TGF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等生成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌，參與腎小球纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCs可低度表達(dá)NF-κB、MCP-1和ICAM-1，高糖作用下細(xì)胞NF-κB、MCP-1 和ICAM-1表達(dá)明顯增加，其機(jī)制可能與高糖通過(guò)PKC、ROS或糖基化終末產(chǎn)物途徑激活NF-κB，上調(diào)MCP-1和ICAM-1表達(dá)有關(guān)。

二甲雙胍作為經(jīng)典降糖藥，近年來(lái)研究［9］顯示其具有抗炎、減輕氧化應(yīng)激、抑制糖基化和脂質(zhì)沉積等部分獨(dú)立于降糖之外的作用。臨床研究［10］表明二甲雙胍可降低DN患者血清高敏C反應(yīng)蛋白、MCP-1和ICAM-1水平，減少尿蛋白和尿MCP-1排泄。對(duì)DM大鼠給予500 mg／kg二甲雙胍8周后，可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積和腎小球基底膜增厚明顯改善［11］。本研究在體外證明二甲雙胍可抑制MCs NF-κB、MCP-1及ICAM-1的表達(dá)，并具有一定的濃度依賴(lài)性，可能通過(guò)抗炎延緩DN進(jìn)展。二甲雙胍直接作用于線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體，通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），下調(diào)NF-κB及下游炎癥因子表達(dá)［9］。二甲雙胍可獨(dú)立于AMPK，直接抑制IκB磷酸化，使NF-κB、MCP-1和ICAM-1合成減少。此外，二甲雙胍可通過(guò)抑制ROS等的生成，下調(diào)炎癥反應(yīng)，延緩纖維化進(jìn)程。

總之，本研究結(jié)果初步提示二甲雙胍可降低高糖誘導(dǎo)的MCs NF-κB、MCP-1和ICAM-1表達(dá)，該作用可能與腎臟保護(hù)有關(guān)，確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of metformin on expression and synthesis of intercellular adhesion molecule-1，monocyte chemoattractant protein-1 and nuclear factor-κB in rat glomerular mesangial cells

Gu Junfei，Ye Shandong，Wang Shan，et al
（Dept of Endocrinology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo observe the effects of metformin on expression and synthesis of nuclear factor-κB（NF-κB），monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）in cultured rat glomerular mesangial cells（MCs）and explore its reno-protective mechanisms.MethodsMCs were cultured in the medium with normal glucose（group NG），high glucose（group HG）and different concentrations of metformin （group M1，M2，M3）.After 48 h exposure，the supernatants and MCs were collected.The expression of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 mRNA was analyzed by Real-time PCR and MCP-1 protein synthesis by ELISA.NF-κBp65 and ICAM-1 were visualized by Western blot.Results①M(fèi)Cs could express NF-κB，ICAM-1and MCP-1.②After being stimulated by high glucose，the levels of intracelluar NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 were significantly increased compared with group NG（P＜0.05）.③The levels of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 were significantly decreased in group M1，M2 and group M3 compared with group HG（P＜0.05）.ConclusionMetformin can suppress the expression and synthesis of NF-κB，MCP-1 and ICAM-1 of glomerular mesangial cells，which may partly contribute to its reno-protection.

metformin；NF-κB；MCP-1；ICAM-1

R 349.51；R 587.24

1000－1492（2014）05－0582－04

2013－12－12接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：11040606M161）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A157）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230001

顧俊菲，女，碩士研究生；

葉山東，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ysd196406＠163.com