基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測茶白星病菌的方法研究

周凌云，劉紅艷，李 維，向 芬，曾 振，王振中

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙410125；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

茶白星?。═ea white scab）是全球高海拔茶園最嚴(yán)重的真菌病害之一。生產(chǎn)上通常采用多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥對該病進行防控，因發(fā)病期常為多雨季節(jié)，不但防效不佳，殺菌劑的過量使用往往導(dǎo)致茶葉農(nóng)殘超標(biāo)。茶白星病在日本、韓國等地分別報道其病原為痂囊腔菌E.leucospila（無性階段為黑盤孢菌Sphaceloma.theae）[1-3]。2000年，Notomi等建立了一種非常實用而又有效的核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP）[4]。LAMP通過針對靶基因的6個特異部位設(shè)定4種引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂形成乳白色沉淀，加入染色劑即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。本文以痂囊腔菌基因為靶基因，利用LAMP技術(shù)擴增靶基因，設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一個茶白星病菌快速LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

痂囊腔菌分離自湖南省石門縣白云山林場茶園的茶白星病葉，由本實驗室分離并保存。

1.2 試 劑

Loopamp?“朗報?”脫氧核糖核酸擴增試劑盒與Loopamp?“朗報?”熒光目視檢測試劑盒均購自北京藍譜生物科技有限公司，真菌DNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 LAMP 法的建立

采用真菌試劑盒抽提痂囊腔菌，將LAMP反應(yīng)體系（引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和緩沖液） 在95℃加熱5 min后冷卻，再加入 8 U Bst DNA 聚酶，在 60℃保溫 60 min，然后在高于80℃的溫度下10 min使Bst DNA聚酶失活終止反應(yīng)。反應(yīng)液混合后觀察離心管中反應(yīng)液顏色，如發(fā)生特異性擴增，直接目視或在紫外燈下觀察，溶液均變?yōu)榫G色，否則保持SYBR Green 橙色不變。

1.3.1 LAMP引物的篩選

參照GenBank中E.leucospila（無性階段為S.theae）基因序列，應(yīng)用Clustal W進行多重比對，分析序列的保守區(qū)，利用在線設(shè)計軟件Primer Explorer V 4.0，設(shè)計 4 套 LA MP 引物，每套引物均包括2條外引物與2 條內(nèi)引物，引物由華大基因科技有限公司合成，根據(jù)顏色變化及其重復(fù)性對引物進行篩選。

1.3.2 LAMP法反應(yīng)優(yōu)化

反應(yīng)溫度選取60℃、61℃、62℃、63℃、64℃這5個溫度條件進行LAMP反應(yīng)，實時觀察反應(yīng)顏色。進一步對引物濃度比例、模板濃度和反應(yīng)時間進行優(yōu)化。

1.4 LAMP 法結(jié)果鑒定

核酸染色法反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，于自然光及紫外燈下觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.4.1 LAMP的敏感性試驗

將抽提E.leucospilaDNA模板分別配置成1x10-2～10-54個稀釋度，用所建立的LAMP和PCR方法進行靈敏性比對試驗。PCR的反應(yīng)體系：配置成25 μL的反應(yīng)體系，引物F1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），R1（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），56℃變性30 s循環(huán)35次。

1.4.2 LAMP特異性實驗

應(yīng)用真菌試劑盒抽提痂囊腔菌屬和茶炭疽病菌DNA，按照所建立痂囊腔菌LAMP檢測方法，進行特異性實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選

根據(jù)S.theae的ITS1序列與E.leucospil的rDNA序列分別設(shè)計了4組引物，最后實驗明確有效的引物對來自Elsinoe屬核糖體DNA的1組特異性引物，分別為外引物1：F3（5’-GGGGACCGAACCAACTCT-3’）；外引物2：B3（5’-TGCCCCTCGGAATACCAAG-3’）；內(nèi)引物 1：FIP（5’-GCCAGAACCAAG AGATC CGTTGT-TCTTGTGAAACCTTTGCA GTC-3’）；內(nèi)引物2：BIP（5’-TGAA GAACGCAGC GAAATGCG-GCGCAATGTGCG TTCAA-3’）。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液12.5 μL，其中FIP：30 pmol，BIP：30 pmol，F(xiàn)3：10 pmol，B3：10 pmol，BstDNA 聚合酶 1 μL，加去離子水 ddH2O成23 μL。其中反應(yīng)緩沖液組成：Tris－HCl（pH8.8）：40 mM，KCl：20 mM，MgSO4:16 mM，（NH4）2SO4：20 mM，Tween20：0.2%，Betaine：1.6 M，dNTPs：2.8 mM。

反應(yīng)條件：63℃反應(yīng)l h后立即于80℃金屬水浴鍋10 min使酶滅活。熒光目視檢測時，向預(yù)混溶液中添加Loopamp?“朗報?”熒光目視檢測試劑，以便肉眼觀察是否檢出E.leucospil。

2.3 特異性實驗

利用已建立的LAMP檢測方法，以痂囊腔菌與茶炭疽病菌（Gloeosporium theae sinensis Miyake）為模板進行特異性試驗。熒光目視與紫外燈檢測結(jié)果均表明，與陽性對照呈色一致的為痂囊腔菌，茶炭疽病菌呈色與陰性對照相同，初步確定本方法設(shè)計的引物對痂囊腔菌具有專一性（圖1）。

圖1-A 特異性實驗的熒光目視檢測結(jié)果（1為陽性對照，2為痂囊腔菌，3為陰性對照）Fig.1-A specificity of the experimental result of the fluorescence visual detection

圖1-B 特異性實驗的紫外檢測結(jié)果（1為陽性對照，2為茶炭疽病，3為陰性對照）Fig.1-B specificity of the experimental results of the ultraviolet detection

2.4 靈敏度實驗

利用已建立的LAMP檢測方法，以稀釋成 10-2、10-3、10-4、10-5的痂囊腔菌 DNA 為模板，以PCR作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1-4號管反應(yīng)液顏色為綠色，LAMP能擴增出10-5痂囊腔菌DNA模板，而PCR的擴增濃度限于10-4痂囊腔菌DNA，從而明確LAMP法在靈敏度上高于PCR10倍（圖2）。

圖2-A 靈敏度實驗的顯色法檢測結(jié)果Fig.2-A sensitivity test results of the color detection method

圖2-B 靈敏度實驗的電泳法檢測結(jié)果Fig.2-B Sensitivity test results of electrophoresis detection method

3 結(jié) 論

本文通過設(shè)計、篩選引物與優(yōu)化反應(yīng)建立了痂囊腔菌的LAMP檢測方法，為茶樹病菌快速檢測構(gòu)建了一個技術(shù)平臺。植物病害如灰葡萄孢菌、鐮刀菌等病菌的鑒定上逐漸采用LAMP方法替代[5-9]。LAMP法較PCR法更加簡便快速，從DNA提取、LAMP反應(yīng)到結(jié)果觀察只需2 h即可完成，比目前普遍采用的PCR檢測方法縮短一倍的時間，而且靈敏度提高10倍，特異性強，儀器要求簡單，一個水浴鍋即可完成，觀察簡單易行，加入了熒光染色劑，在日光下即可清晰直觀反應(yīng)結(jié)果，具有對低濃度菌致病早期鑒定的價值，適宜實驗室與基層田間使用。

但本研究通過LAMP快速檢測的痂囊腔菌屬，僅限于分離菌抽提DNA為模板，尚需要優(yōu)化病葉直接抽提DNA，進行LAMP技術(shù)需進一步優(yōu)化以適合于各種現(xiàn)場應(yīng)用場合。其次，由于LAMP只需少量模板，即可獲得大量特異性擴增產(chǎn)物，應(yīng)避免局域環(huán)境被這些產(chǎn)物污染，除了提高操作的速度與嚴(yán)密性，需進一步優(yōu)化反應(yīng)材料，加強茶白星病快速檢測和鑒定水平。

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